Penyakit Alzheimer (AD) tidak memiliki biomarker protein yang mencerminkan berbagai patofisiologi yang mendasarinya, sehingga menghambat kemajuan diagnosis dan pengobatan. Di sini, kami menggunakan proteomik komprehensif untuk mengidentifikasi biomarker cairan serebrospinal (CSF) yang mewakili berbagai patofisiologi AD. Spektrometri massa multipleks mengidentifikasi masing-masing sekitar 3.500 dan sekitar 12.000 protein di CSF AD dan otak. Analisis jaringan proteom otak menyelesaikan 44 modul keanekaragaman hayati, 15 di antaranya tumpang tindih dengan proteom cairan serebrospinal. Penanda CSF AD dalam modul yang tumpang tindih ini dilipat menjadi lima kelompok protein, yang mewakili proses patofisiologis yang berbeda. Sinapsis dan metabolit di otak AD menurun, tetapi CSF meningkat, sedangkan kelompok mielinisasi dan imun yang kaya glial di otak dan CSF meningkat. Konsistensi dan spesifisitas penyakit dari perubahan panel dikonfirmasi pada lebih dari 500 sampel CSF tambahan. Kelompok-kelompok ini juga mengidentifikasi subkelompok biologis pada DA tanpa gejala. Secara keseluruhan, hasil ini merupakan langkah menjanjikan menuju alat biomarker berbasis web untuk aplikasi klinis pada DA.
Penyakit Alzheimer (AD) adalah penyebab paling umum dari demensia neurodegeneratif di seluruh dunia dan ditandai dengan berbagai disfungsi sistem biologis, termasuk transmisi sinaptik, imunitas yang dimediasi glial, dan metabolisme mitokondria (1-3). Namun, biomarker protein yang ada masih fokus pada pendeteksian protein amiloid dan tau, sehingga tidak dapat mencerminkan patofisiologi yang beragam ini. Biomarker protein “inti” yang paling andal diukur dalam cairan serebrospinal (CSF) meliputi (i) amiloid beta peptida 1-42 (Aβ1-42), yang mencerminkan pembentukan plak amiloid kortikal; (ii) tau total, tanda degenerasi akson; (iii) fosfo-tau (p-tau), perwakilan dari hiperfosforilasi tau patologis (4-7). Meskipun biomarker cairan serebrospinal ini sangat memudahkan kita dalam mendeteksi penyakit protein AD yang “ditandai” (4-7), biomarker ini hanya mewakili sebagian kecil dari biologi kompleks di balik penyakit tersebut.
Kurangnya keragaman patofisiologi biomarker DA telah menimbulkan banyak tantangan, termasuk (i) ketidakmampuan untuk mengidentifikasi dan mengukur heterogenitas biologis pasien DA, (ii) tidak memadainya pengukuran tingkat keparahan dan perkembangan penyakit, terutama pada tahap praklinis, dan ( iii) pengembangan obat-obatan terapeutik yang gagal menyelesaikan seluruh aspek kerusakan neurologis. Ketergantungan kita pada patologi penting untuk menggambarkan DA dari penyakit terkait hanya memperburuk masalah ini. Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa sebagian besar lansia dengan demensia memiliki lebih dari satu karakteristik patologis penurunan kognitif (8). Sebanyak 90% atau lebih individu dengan patologi DA juga memiliki penyakit vaskular, inklusi TDP-43, atau penyakit degeneratif lainnya (9). Tingginya proporsi tumpang tindih patologis ini telah mengganggu kerangka diagnostik demensia saat ini, dan diperlukan definisi patofisiologis penyakit yang lebih komprehensif.
Mengingat kebutuhan mendesak akan berbagai biomarker AD, bidang ini semakin banyak mengadopsi metode “omics” berdasarkan sistem keseluruhan untuk menemukan biomarker. Aliansi Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD diluncurkan pada tahun 2014 dan berada di garis depan program ini. Upaya multidisiplin yang dilakukan oleh Institut Kesehatan Nasional, akademisi, dan industri ini bertujuan untuk menggunakan strategi berbasis sistem untuk lebih mendefinisikan patofisiologi DA dan mengembangkan analisis diagnostik keanekaragaman hayati dan strategi pengobatan (10). Sebagai bagian dari proyek ini, proteomik jaringan telah menjadi alat yang menjanjikan untuk kemajuan biomarker berbasis sistem di AD. Pendekatan berbasis data yang tidak memihak ini mengatur kumpulan data proteomik yang kompleks ke dalam kelompok atau “modul” protein yang diekspresikan bersama yang terkait dengan tipe sel, organel, dan fungsi biologis tertentu (11-13). Hampir 12 studi proteomik jaringan yang kaya informasi telah dilakukan pada otak AD (13-23). Secara keseluruhan, analisis ini menunjukkan bahwa proteom jaringan otak AD mempertahankan organisasi modular yang sangat terpelihara dalam kelompok independen dan beberapa wilayah kortikal. Selain itu, beberapa modul ini menunjukkan perubahan yang dapat direproduksi dalam kelimpahan terkait AD di seluruh kumpulan data, yang mencerminkan patofisiologi berbagai penyakit. Secara kolektif, temuan ini menunjukkan titik awal yang menjanjikan untuk penemuan proteom jaringan otak sebagai biomarker berbasis sistem pada AD.
Untuk mengubah proteom jaringan otak AD menjadi biomarker berbasis sistem yang berguna secara klinis, kami menggabungkan jaringan yang diturunkan dari otak dengan analisis proteomik AD CSF. Pendekatan terpadu ini menghasilkan identifikasi lima set biomarker CSF yang menjanjikan yang berhubungan dengan berbagai patofisiologi berbasis otak, termasuk sinapsis, pembuluh darah, mielinisasi, peradangan, dan disfungsi jalur metabolisme. Kami berhasil memvalidasi panel biomarker ini melalui berbagai analisis replikasi, termasuk lebih dari 500 sampel CSF dari berbagai penyakit neurodegeneratif. Analisis validasi ini mencakup pemeriksaan target kelompok di CSF pasien dengan AD tanpa gejala (AsymAD) atau menunjukkan bukti akumulasi amiloid abnormal dalam lingkungan kognitif normal. Analisis ini menyoroti heterogenitas biologis yang signifikan pada populasi AsymAD dan mengidentifikasi penanda panel yang mungkin dapat membuat subtipe individu pada tahap awal penyakit. Secara keseluruhan, hasil ini mewakili langkah kunci dalam pengembangan alat biomarker protein berdasarkan berbagai sistem yang berhasil memecahkan banyak tantangan klinis yang dihadapi oleh AD.
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi biomarker cairan serebrospinal baru yang mencerminkan berbagai patofisiologi berbasis otak yang mengarah pada DA. Gambar S1 menguraikan metodologi penelitian kami, yang mencakup (i) analisis komprehensif yang didorong oleh temuan awal AD CSF dan jaringan proteom otak untuk mengidentifikasi beberapa biomarker penyakit CSF terkait otak, dan (ii) replikasi selanjutnya Biomarker ini ada di beberapa serebrospinal independen kelompok yang cair. Penelitian berorientasi penemuan dimulai dengan analisis perbedaan ekspresi CSF pada 20 individu dengan kognitif normal dan 20 pasien AD di Pusat Penelitian Penyakit Alzheimer (ADRC) Emory Goizueta. Diagnosis DA didefinisikan sebagai gangguan kognitif yang signifikan dengan adanya Aβ1-42 yang rendah dan peningkatan kadar total tau dan p-tau dalam cairan serebrospinal [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Tabel S1A). Kontrol (rata-rata MoCA, 26,7 ± 2,2) memiliki tingkat biomarker CSF yang normal.
CSF manusia dicirikan oleh kisaran kelimpahan protein yang dinamis, di mana albumin dan protein lain yang sangat melimpah dapat mencegah deteksi protein yang diinginkan (24). Untuk meningkatkan kedalaman penemuan protein, kami menghilangkan 14 protein pertama yang sangat melimpah dari setiap sampel CSF sebelum analisis spektrometri massa (MS) (24). Sebanyak 39.805 peptida diidentifikasi oleh MS, yang dipetakan ke 3691 proteom dalam 40 sampel. Kuantifikasi protein dilakukan dengan pelabelan multiple tandem mass tag (TMT) (18, 25). Untuk mengatasi data yang hilang, kami hanya memasukkan protein-protein yang dikuantifikasi dalam setidaknya 50% sampel dalam analisis selanjutnya, sehingga akhirnya mengkuantifikasi 2.875 proteom. Karena perbedaan yang signifikan dalam tingkat kelimpahan protein total, sampel kontrol secara statistik dianggap sebagai outlier (13) dan tidak dimasukkan dalam analisis selanjutnya. Nilai kelimpahan dari 39 sampel yang tersisa disesuaikan menurut usia, jenis kelamin, dan kovarians batch (13-15, 17, 18, 20, 26).
Dengan menggunakan analisis uji-t statistik untuk mengevaluasi ekspresi diferensial pada kumpulan data regresi, analisis ini mengidentifikasi protein yang tingkat kelimpahannya berubah secara signifikan (P <0,05) antara kontrol dan kasus AD (Tabel S2A). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1A, kelimpahan total 225 protein pada AD berkurang secara signifikan, dan kelimpahan 303 protein meningkat secara signifikan. Protein yang diekspresikan secara berbeda ini mencakup beberapa penanda AD cairan serebrospinal yang telah diidentifikasi sebelumnya, seperti protein terkait mikrotubulus tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilamen (NEFL; P = 6,56 × 10−3), Protein terkait pertumbuhan 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Protein Pengikat Asam Lemak 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Kitinase 3 seperti 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) dan faktor pertumbuhan saraf VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Namun, kami juga mengidentifikasi target lain yang sangat penting, seperti penghambat disosiasi PDB 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) dan pengikatan kalsium modular terkait SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Analisis Gene Ontology (GO) terhadap 225 protein yang berkurang secara signifikan mengungkapkan hubungan erat dengan proses cairan tubuh seperti metabolisme steroid, pembekuan darah, dan aktivitas hormon (Gambar 1B dan Tabel S2B). Sebaliknya, peningkatan protein 303 secara signifikan berkaitan erat dengan struktur sel dan metabolisme energi.
(A) Plot gunung berapi menunjukkan perubahan lipatan log2 (sumbu x) relatif terhadap nilai P statistik -log10 (sumbu y) yang diperoleh dari uji-t, yang digunakan untuk mendeteksi ekspresi diferensial antara kontrol (CT) dan Kasus AD dari proteom CSF Dari semua protein. Protein dengan tingkat penurunan yang signifikan (P <0,05) pada AD ditunjukkan dengan warna biru, sedangkan protein dengan tingkat peningkatan penyakit yang signifikan ditunjukkan dengan warna merah. Protein yang dipilih diberi label. (B) Istilah GO teratas yang terkait dengan protein berkurang secara signifikan (biru) dan meningkat (merah) pada AD. Menunjukkan tiga istilah GO dengan skor z tertinggi di bidang proses biologis, fungsi molekuler, dan komponen seluler. (C) MS mengukur level MAPT dalam sampel CSF (kiri) dan korelasinya dengan level ELISA tau sampel (kanan). Koefisien korelasi Pearson dengan nilai P yang relevan ditampilkan. Karena kurangnya data ELISA untuk satu kasus AD, angka-angka ini mencakup nilai untuk 38 dari 39 kasus yang dianalisis. (D) Analisis klaster yang diawasi (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) menyesuaikan P <0,01) pada kontrol dan AD CSF menemukan sampel menggunakan 65 protein yang mengalami perubahan paling signifikan dalam kumpulan data. Standarisasi, normalisasi.
Tingkat proteomik MAPT berkaitan erat dengan tingkat ELISA tau yang diukur secara independen (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Gambar 1C), mendukung validitas pengukuran MS kami. Setelah pencernaan trypsin pada tingkat protein prekursor amiloid (APP), peptida spesifik isoform yang dipetakan ke terminal-C Aβ1-40 dan Aβ1-42 tidak dapat terionisasi secara efisien (27, 28). Oleh karena itu, peptida APP yang kami identifikasi tidak ada hubungannya dengan level ELISA Aβ1-42. Untuk mengevaluasi ekspresi diferensial dari setiap kasus, kami menggunakan protein yang diekspresikan secara berbeda dengan P <0,0001 [tingkat penemuan palsu (FDR) mengoreksi P <0,01] untuk melakukan analisis cluster sampel yang diawasi (Tabel S2A). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1D, 65 protein yang sangat signifikan ini dapat mengelompokkan sampel dengan benar berdasarkan kondisi penyakit, kecuali untuk satu kasus AD dengan karakteristik seperti kontrol. Dari 65 protein tersebut, 63 meningkat pada DA, sementara hanya dua (CD74 dan ISLR) yang menurun. Secara total, analisis cairan serebrospinal ini telah mengidentifikasi ratusan protein pada DA yang dapat berfungsi sebagai penanda biologis penyakit.
Kemudian kami melakukan analisis jaringan independen terhadap proteom otak AD. Kelompok otak dari penemuan ini termasuk korteks prefrontal dorsolateral (DLPFC) dari kontrol (n = 10), penyakit Parkinson (PD; n = 10), kasus AD/PD campuran (n = 10) dan AD (n = 10). ) Sampel. Emery Goizueta ADRC. Demografi dari 40 kasus ini telah dijelaskan sebelumnya (25) dan dirangkum dalam Tabel S1B. Kami menggunakan TMT-MS untuk menganalisis 40 jaringan otak ini dan kelompok replikasi dari 27 kasus. Secara total, kedua kumpulan data otak ini menghasilkan 227.121 peptida unik, yang dipetakan ke 12.943 proteom (25). Hanya protein yang diukur pada setidaknya 50% kasus yang dimasukkan dalam penyelidikan selanjutnya. Kumpulan data penemuan akhir berisi 8817 protein terukur. Sesuaikan tingkat kelimpahan protein berdasarkan usia, jenis kelamin, dan interval post-mortem (PMI). Analisis ekspresi diferensial dari kumpulan data setelah regresi menunjukkan bahwa >2000 kadar protein berubah secara signifikan [P <0,05, analisis varians (ANOVA)] pada dua atau lebih kelompok penyakit. Kemudian, kami melakukan analisis cluster yang diawasi berdasarkan pada protein yang diekspresikan secara berbeda, dan P <0,0001 dalam perbandingan AD/kontrol dan/atau AD/PD (Gambar S2, A dan B, Tabel S2C). 165 protein yang sangat berubah ini dengan jelas menggambarkan kasus-kasus dengan patologi AD dari sampel kontrol dan PD, mengkonfirmasikan perubahan spesifik AD yang kuat di seluruh proteom.
Kami kemudian menggunakan algoritma yang disebut Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) untuk melakukan analisis jaringan pada proteome otak yang ditemukan, yang mengatur kumpulan data ke dalam modul protein dengan pola ekspresi serupa (11-13). Analisis mengidentifikasi 44 modul (M) protein yang diekspresikan bersama, diurutkan dan diberi nomor dari yang terbesar (M1, n = 1821 protein) hingga yang terkecil (M44, n = 34 protein) (Gambar 2A dan Tabel S2D). Seperti disebutkan di atas (13) Hitung profil ekspresi representatif atau protein karakteristik dari setiap modul, dan korelasikan dengan keadaan penyakit dan patologi AD, yaitu membentuk aliansi Alzheimer's Disease Registry (CERAD) dan Braak Score (Gambar 2B). Secara keseluruhan, 17 modul secara signifikan berhubungan dengan neuropatologi AD (P <0,05). Banyak dari modul yang berhubungan dengan penyakit ini juga kaya akan penanda spesifik tipe sel (Gambar 2B). Seperti disebutkan di atas (13), pengayaan tipe sel ditentukan dengan menganalisis modul yang tumpang tindih dan daftar referensi gen spesifik tipe sel. Gen-gen ini berasal dari data yang dipublikasikan pada neuron tikus terisolasi, sel endotel dan glial. Eksperimen sekuensing RNA (RNA-seq) (29).
(A) Temukan WGCNA proteom otak. (B) Analisis midkorelasi biweight (BiCor) dari protein tanda tangan modular (komponen utama pertama dari ekspresi protein modular) dengan karakteristik neuropatologis AD (atas), termasuk skor CERAD (plak Aβ) dan Braak (tau tangles). Intensitas korelasi positif (merah) dan negatif (biru) ditunjukkan oleh peta panas dua warna, dan tanda bintang menunjukkan signifikansi statistik (P <0,05). Gunakan Uji Tepat Hypergeometric Fisher (FET) (bawah) untuk menilai hubungan jenis sel setiap modul protein. Intensitas bayangan merah menunjukkan tingkat pengayaan jenis sel, dan tanda bintang menunjukkan signifikansi statistik (P <0,05). Gunakan metode BH untuk mengoreksi nilai P yang diperoleh dari FET. (C) Analisis GO protein modular. Proses biologis yang paling erat kaitannya ditampilkan untuk setiap modul atau kelompok modul terkait. oligo, oligodendrosit.
Satu set lima modul kaya astrosit dan mikroglia yang terkait erat (M30, M29, M18, M24, dan M5) menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan neuropatologi AD (Gambar 2B). Analisis ontologi menghubungkan modul glial ini dengan pertumbuhan, proliferasi, dan imunitas sel (Gambar 2C dan Tabel S2E). Dua modul glial tambahan, M8 dan M22, juga mengalami peningkatan regulasi yang kuat dalam hal penyakit. M8 sangat terkait dengan jalur reseptor mirip Tol, sebuah kaskade sinyal yang memainkan peran kunci dalam respons imun bawaan (30). Pada saat yang sama, M22 terkait erat dengan modifikasi pasca-translasi. M2, yang kaya akan oligodendrosit, menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan patologi AD dan hubungan ontologis dengan sintesis nukleosida dan replikasi DNA, yang menunjukkan peningkatan proliferasi sel pada penyakit. Secara keseluruhan, temuan ini mendukung peningkatan modul glial yang sebelumnya telah kami amati pada proteom jaringan AD (13, 17). Saat ini ditemukan bahwa banyak modul glial terkait AD di jaringan menunjukkan tingkat ekspresi yang lebih rendah pada kasus kontrol dan PD, sehingga menyoroti spesifisitas penyakit yang meningkat pada AD (Gambar S2C).
Hanya empat modul dalam proteom jaringan kami (M1, M3, M10, dan M32) yang berkorelasi sangat negatif dengan patologi AD (P <0,05) (Gambar 2, B dan C). Baik M1 dan M3 kaya akan penanda saraf. M1 sangat berkaitan dengan sinyal sinaptik, sedangkan M3 berkaitan erat dengan fungsi mitokondria. Tidak ada bukti pengayaan tipe sel untuk M10 dan M32. M32 mencerminkan hubungan antara M3 dan metabolisme sel, sedangkan M10 sangat terkait dengan pertumbuhan sel dan fungsi mikrotubulus. Dibandingkan dengan AD, keempat modul ditingkatkan dalam kontrol dan PD, sehingga memberikan perubahan AD spesifik penyakit (Gambar S2C). Secara keseluruhan, hasil ini mendukung penurunan kelimpahan modul kaya neuron yang sebelumnya kami amati pada AD (13, 17). Singkatnya, analisis jaringan proteom otak yang kami temukan menghasilkan modul yang diubah secara khusus oleh AD, konsisten dengan temuan kami sebelumnya.
AD ditandai dengan tahap awal tanpa gejala (AsymAD), di mana individu menunjukkan akumulasi amiloid tanpa penurunan kognitif klinis (5, 31). Tahap tanpa gejala ini merupakan jendela penting untuk deteksi dini dan intervensi. Kami sebelumnya telah menunjukkan pelestarian modular yang kuat dari proteom jaringan otak AsymAD dan AD di seluruh kumpulan data independen (13, 17). Untuk memastikan bahwa jaringan otak yang kami temukan saat ini konsisten dengan temuan sebelumnya, kami menganalisis pelestarian 44 modul dalam kumpulan data yang direplikasi dari 27 organisasi DLPFC. Organisasi-organisasi ini termasuk kasus kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8 ) dan AD (n = 9). Sampel kontrol dan AD dimasukkan dalam analisis kelompok otak penemuan kami (Tabel S1B), sedangkan kasus AsymAD unik hanya dalam kelompok replikasi. Kasus AsymAD ini juga berasal dari bank otak Emory Goizueta ADRC. Meskipun kognisi normal pada saat kematian, kadar amiloid sangat tinggi (rata-rata CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tabel S1B).
Analisis TMT-MS terhadap 27 jaringan otak ini menghasilkan kuantifikasi 11.244 proteom. Penghitungan akhir ini hanya mencakup protein yang diukur pada setidaknya 50% sampel. Kumpulan data yang direplikasi ini berisi 8638 (98,0%) dari 8817 protein yang terdeteksi dalam analisis otak penemuan kami, dan memiliki hampir 3000 protein yang berubah secara signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok AD (P <0,05, setelah uji t berpasangan Tukey untuk analisis varians) ( Tabel S2F). Di antara protein-protein yang diekspresikan secara berbeda ini, 910 juga menunjukkan perubahan tingkat yang signifikan antara AD dan kasus kontrol proteom otak (P <0,05, setelah uji-t berpasangan ANOVA Tukey). Perlu dicatat bahwa penanda 910 ini sangat konsisten dalam arah perubahan antar proteom (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Gambar S3A). Di antara peningkatan protein, protein dengan perubahan paling konsisten antar kumpulan data sebagian besar adalah anggota modul M5 dan M18 yang kaya glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, dan GFAP). Di antara protein tereduksi, protein dengan perubahan paling konsisten hampir secara eksklusif merupakan anggota modul M1 (NPTX2, VGF, dan RPH3A) yang terkait dengan sinapsis. Kami selanjutnya memverifikasi perubahan midkine (MDK), CD44, yang terkait dengan AD, mensekresi protein 1 terkait frizzled (SFRP1) dan VGF dengan western blotting (Gambar S3B). Analisis pelestarian modul menunjukkan bahwa sekitar 80% modul protein (34/44) dalam proteom otak dilestarikan secara signifikan dalam kumpulan data replikasi (skor-z> 1,96, FDR mengoreksi P <0,05) (Gambar S3C). Empat belas modul ini secara khusus dicadangkan di antara dua proteom (skor-z> 10, FDR mengoreksi P <1,0 × 10−23). Secara keseluruhan, penemuan dan replikasi konsistensi tingkat tinggi dalam ekspresi diferensial dan komposisi modular antara proteom otak menyoroti reproduktifitas perubahan protein korteks frontal AD. Selain itu, juga dipastikan bahwa AsymAD dan penyakit yang lebih lanjut memiliki struktur jaringan otak yang sangat mirip.
Analisis yang lebih rinci tentang ekspresi diferensial dalam kumpulan data replikasi otak menyoroti tingkat signifikan perubahan protein AsymAD, termasuk total 151 protein yang berubah secara signifikan antara AsymAD dan kontrol (P <0,05) (Gambar S3D). Konsisten dengan beban amiloid, APP di otak AsymAD dan AD meningkat secara signifikan. MAPT hanya berubah secara signifikan pada AD, yang konsisten dengan peningkatan tingkat kekusutan dan korelasinya dengan penurunan kognitif (5, 7). Modul kaya glial (M5 dan M18) sangat tercermin dalam peningkatan protein di AsymAD, sedangkan modul M1 yang berhubungan dengan neuron adalah yang paling mewakili penurunan protein di AsymAD. Banyak dari penanda AsymAD ini menunjukkan perubahan gejala penyakit yang lebih besar. Di antara penanda tersebut adalah SMOC1, protein glial milik M18, yang berhubungan dengan tumor otak dan perkembangan mata dan anggota badan (32). MDK adalah faktor pertumbuhan pengikat heparin yang terkait dengan pertumbuhan sel dan angiogenesis (33), anggota lain dari M18. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, AsymAD meningkat secara signifikan, diikuti peningkatan AD yang lebih besar. Sebaliknya, protein sinaptik neuropentraxin 2 (NPTX2) berkurang secara signifikan di otak AsymAD. NPTX2 sebelumnya dikaitkan dengan neurodegenerasi dan memiliki peran yang diakui dalam memediasi sinapsis rangsang (34). Secara keseluruhan, hasil ini mengungkapkan berbagai perubahan protein praklinis berbeda pada DA yang tampaknya berkembang seiring dengan tingkat keparahan penyakit.
Mengingat bahwa kami telah mencapai cakupan protein yang sangat mendalam dalam penemuan proteom otak, kami mencoba untuk memahami lebih lengkap tumpang tindihnya dengan transkriptome AD tingkat jaringan. Oleh karena itu, kami membandingkan proteom otak yang kami temukan dengan modul yang kami hasilkan sebelumnya dari pengukuran microarray 18.204 gen pada jaringan DLPFC AD (n = 308) dan kontrol (n = 157) (13). tumpang tindih. Secara total, kami mengidentifikasi 20 modul RNA yang berbeda, banyak di antaranya menunjukkan pengayaan tipe sel tertentu, termasuk neuron, oligodendrosit, astrosit, dan mikroglia (Gambar 3A). Berbagai perubahan modul ini di AD ditunjukkan pada Gambar 3B. Konsisten dengan analisis tumpang tindih protein-RNA kami sebelumnya menggunakan proteom MS tanpa label yang lebih dalam (sekitar 3000 protein) (13), sebagian besar dari 44 modul dalam jaringan proteom otak yang kami temukan berada di jaringan transkriptome. Tidak ada tumpang tindih yang signifikan. Bahkan di penemuan dan replikasi kami terhadap 34 modul protein yang sangat tersimpan dalam proteom otak, hanya 14 (~40%) yang lulus uji eksak Fisher (FET) terbukti memiliki tumpang tindih yang signifikan secara statistik dengan transkriptome (Gambar 3A). Kompatibel dengan perbaikan kerusakan DNA (P-M25 dan P-M19), translasi protein (P-M7 dan P-M20), pengikatan/penyambungan RNA (P-M16 dan P-M21) dan penargetan protein (P-M13 dan P- M23) tidak tumpang tindih dengan modul di transkriptome. Oleh karena itu, meskipun kumpulan data proteom yang lebih dalam digunakan dalam analisis tumpang tindih saat ini (13), sebagian besar proteom jaringan AD tidak dipetakan ke jaringan transkriptome.
(A) FET hipergeometri menunjukkan pengayaan penanda spesifik tipe sel dalam modul RNA dari transkriptom AD (atas) dan tingkat tumpang tindih antara modul RNA (sumbu x) dan protein (sumbu y) dari otak AD (dasar) . Intensitas arsiran merah menunjukkan tingkat pengayaan jenis sel di panel atas dan intensitas tumpang tindih modul di panel bawah. Tanda bintang menunjukkan signifikansi statistik (P <0,05). (B) Derajat korelasi antara gen karakteristik setiap modul transkriptom dan status AD. Modul di sebelah kiri berkorelasi paling negatif dengan AD (biru), dan modul di sebelah kanan berkorelasi paling positif dengan AD (merah). Nilai P yang dikoreksi BH yang ditransformasikan secara log menunjukkan tingkat signifikansi statistik dari setiap korelasi. (C) Modul tumpang tindih yang signifikan dengan pengayaan tipe sel bersama. (D) Analisis korelasi perubahan lipatan log2 protein berlabel (sumbu x) dan RNA (sumbu y) pada modul yang tumpang tindih. Koefisien korelasi Pearson dengan nilai P yang relevan ditampilkan. Mikro, mikroglia; benda langit, astrosit. CT, kontrol.
Sebagian besar modul protein dan RNA yang tumpang tindih memiliki profil pengayaan tipe sel yang serupa dan arah perubahan AD yang konsisten (Gambar 3, B dan C). Dengan kata lain, modul M1 yang berhubungan dengan sinapsis dari proteom otak (PM1) dipetakan ke tiga modul RNA homolog kaya neuron (R-M1, R-M9 dan R-M16), yang berada di AD. Keduanya menunjukkan tingkat yang berkurang. Demikian pula, modul protein M5 dan M18 yang kaya glial tumpang tindih dengan modul RNA yang kaya akan astrosit dan penanda mikroglial (R-M3, R-M7, dan R-M10) dan sangat terlibat dalam peningkatan penyakit. Fitur modular bersama antara dua kumpulan data ini semakin mendukung pengayaan jenis sel dan perubahan terkait penyakit yang telah kami amati pada proteom otak. Namun, kami mengamati banyak perbedaan signifikan antara tingkat RNA dan protein penanda individu dalam modul bersama ini. Analisis korelasi ekspresi diferensial proteomik dan transkriptomik molekul dalam modul yang tumpang tindih ini (Gambar 3D) menyoroti ketidakkonsistenan ini. Misalnya, APP dan beberapa protein modul glial lainnya (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, dan SFRP1) menunjukkan peningkatan yang signifikan pada proteom AD, tetapi hampir tidak ada perubahan pada transkriptome AD. Perubahan spesifik protein ini mungkin terkait erat dengan plak amiloid (23, 35), yang menyoroti proteom sebagai sumber perubahan patologis, dan perubahan ini mungkin tidak tercermin dalam transkriptom.
Setelah menganalisis secara independen proteom otak dan CSF yang kami temukan, kami melakukan analisis komprehensif terhadap dua kumpulan data untuk mengidentifikasi biomarker AD CSF yang terkait dengan patofisiologi jaringan otak. Pertama-tama kita harus mendefinisikan tumpang tindih kedua proteom tersebut. Meskipun diterima secara luas bahwa CSF mencerminkan perubahan neurokimia di otak AD (4), tingkat tumpang tindih yang tepat antara otak AD dan proteom CSF masih belum jelas. Dengan membandingkan jumlah produk gen bersama yang terdeteksi di dua proteom kami, kami menemukan bahwa hampir 70% (n = 1936) protein yang diidentifikasi dalam cairan serebrospinal juga diukur di otak (Gambar 4A). Sebagian besar protein yang tumpang tindih ini (n = 1721) dipetakan ke salah satu dari 44 modul ekspresi bersama dari kumpulan data otak penemuan (Gambar 4B). Seperti yang diharapkan, enam modul otak terbesar (M1 hingga M6) menunjukkan jumlah CSF yang tumpang tindih terbesar. Namun, ada modul otak yang lebih kecil (misalnya, M15 dan M29) yang mencapai tingkat tumpang tindih yang sangat tinggi, lebih besar dari modul otak yang berukuran dua kali lipat. Hal ini memotivasi kami untuk mengadopsi metode yang lebih rinci dan berbasis statistik untuk menghitung tumpang tindih antara otak dan cairan serebrospinal.
(A dan B) Protein yang terdeteksi di otak penemuan dan kumpulan data CSF tumpang tindih. Sebagian besar protein yang tumpang tindih ini berhubungan dengan salah satu dari 44 modul ekspresi bersama di jaringan ekspresi bersama otak. (C) Temukan tumpang tindih antara proteom cairan serebrospinal dan proteom jaringan otak. Setiap baris peta panas mewakili analisis tumpang tindih terpisah dari FET hipergeometri. Baris atas menggambarkan tumpang tindih (arsir abu-abu/hitam) antara modul otak dan seluruh proteom CSF. Baris kedua menggambarkan bahwa tumpang tindih antara modul otak dan protein CSF (diwarnai dengan warna merah) secara signifikan diatur dalam AD (P <0,05). Baris ketiga menunjukkan bahwa tumpang tindih antara modul otak dan protein CSF (warna biru) secara signifikan menurunkan regulasi pada AD (P <0,05). Gunakan metode BH untuk mengoreksi nilai P yang diperoleh dari FET. (D) Panel modul lipat berdasarkan asosiasi tipe sel dan istilah GO terkait. Panel ini mengandung total 271 protein yang berhubungan dengan otak, yang memiliki ekspresi diferensial yang berarti dalam proteom CSF.
Dengan menggunakan FET berekor tunggal, kami menilai pentingnya tumpang tindih protein antara proteom CSF dan modul otak individu. Analisis mengungkapkan bahwa total 14 modul otak dalam kumpulan data CSF memiliki tumpang tindih yang signifikan secara statistik (FDR disesuaikan P <0,05), dan modul tambahan (M18) yang tumpang tindihnya mendekati signifikansi (FDR disesuaikan P = 0,06) (Gambar 4C , baris atas). Kami juga tertarik pada modul yang sangat tumpang tindih dengan protein CSF yang diekspresikan secara berbeda. Oleh karena itu, kami menerapkan dua analisis FET tambahan untuk menentukan mana dari (i) protein CSF yang meningkat secara signifikan pada AD dan (ii) protein CSF yang menurun secara signifikan pada AD (P <0,05, uji t berpasangan AD/kontrol) Modul otak dengan tumpang tindih yang bermakna di antara mereka. Seperti yang ditunjukkan pada baris tengah dan bawah Gambar 4C, analisis tambahan ini menunjukkan bahwa 8 dari 44 modul otak secara signifikan tumpang tindih dengan protein yang ditambahkan dalam AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, dan M38) . ), sementara hanya dua modul (M6 dan M15) yang menunjukkan tumpang tindih yang berarti dengan berkurangnya protein dalam AD CSF. Seperti yang diharapkan, semua 10 modul berada di 15 modul dengan tumpang tindih tertinggi dengan proteom CSF. Oleh karena itu, kami berasumsi bahwa 15 modul ini adalah sumber biomarker CSF yang diturunkan dari otak AD dengan hasil tinggi.
Kami melipat 15 modul yang tumpang tindih ini menjadi lima panel protein besar berdasarkan kedekatannya dalam diagram pohon WGCNA dan hubungannya dengan tipe sel dan ontologi gen (Gambar 4D). Panel pertama berisi modul yang kaya akan penanda neuron dan protein terkait sinapsis (M1 dan M12). Panel sinaptik berisi total 94 protein, dan kadar proteom CSF telah berubah secara signifikan, menjadikannya sumber penanda CSF terkait otak terbesar di antara lima panel. Kelompok kedua (M6 dan M15) menunjukkan hubungan erat dengan penanda sel endotel dan tubuh vaskular, seperti “penyembuhan luka” (M6) dan “regulasi respon imun humoral” (M15). M15 juga sangat terkait dengan metabolisme lipoprotein, yang berkaitan erat dengan endotel (36). Panel vaskular berisi 34 penanda CSF yang berhubungan dengan otak. Kelompok ketiga mencakup modul (M2 dan M4) yang secara signifikan berhubungan dengan penanda oligodendrosit dan proliferasi sel. Misalnya, istilah ontologi tingkat atas M2 mencakup “regulasi positif replikasi DNA” dan “proses biosintesis purin”. Sedangkan M4 meliputi “diferensiasi sel glial” dan “segregasi kromosom”. Panel mielinisasi berisi 49 penanda CSF yang berhubungan dengan otak.
Kelompok keempat berisi modul terbanyak (M30, M29, M18, M24, dan M5), dan hampir semua modul kaya akan penanda mikroglia dan astrosit. Mirip dengan panel mielinisasi, panel keempat juga berisi modul (M30, M29, dan M18) yang berkaitan erat dengan proliferasi sel. Modul lain dalam kelompok ini sangat terkait dengan istilah imunologi, seperti “proses efek imun” (M5) dan “regulasi respon imun” (M24). Kelompok imun glial mengandung 42 penanda CSF yang berhubungan dengan otak. Terakhir, panel terakhir mencakup 52 penanda terkait otak pada empat modul (M44, M3, M33, dan M38), yang semuanya ada di tubuh terkait penyimpanan energi dan metabolisme. Modul terbesar (M3) terkait erat dengan mitokondria dan kaya akan penanda spesifik neuron. M38 adalah salah satu anggota modul yang lebih kecil dalam metabolisme ini dan juga menunjukkan spesifisitas neuron yang moderat.
Secara keseluruhan, kelima panel ini mencerminkan berbagai jenis sel dan fungsi di korteks AD, dan secara kolektif mengandung 271 penanda CSF terkait otak (Tabel S2G). Untuk mengevaluasi validitas hasil MS ini, kami menggunakan proximity extension assay (PEA), sebuah teknologi berbasis antibodi ortogonal dengan kemampuan multiplexing, sensitivitas dan spesifisitas tinggi, dan menganalisis ulang sampel cairan serebrospinal yang kami temukan. Subset dari 271 biomarker ini (n = 36). 36 target ini menunjukkan perubahan kelipatan AD PEA, yang terkait erat dengan temuan berbasis MS kami (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), yang sangat memverifikasi hasil analisis MS komprehensif kami (Gambar S4 ).
Tema biologis yang ditekankan oleh lima kelompok kami, mulai dari sinyal sinaptik hingga metabolisme energi, semuanya terkait dengan patogenesis DA (1-3). Oleh karena itu, ke-15 modul yang berisi panel ini terkait dengan patologi AD pada proteom otak yang kami temukan (Gambar 2B). Yang paling menonjol adalah korelasi patologis positif yang tinggi antara modul glial kita dan korelasi patologis negatif yang kuat antara modul saraf terbesar kita (M1 dan M3). Analisis ekspresi diferensial dari proteom otak kami yang direplikasi (Gambar S3D) juga menyoroti protein glial yang diturunkan dari M5 dan M18. Pada AsymAD dan AD simtomatik, protein glial meningkat paling banyak dan sinapsis terkait M1. Protein mengalami penurunan paling besar. Pengamatan ini menunjukkan bahwa 271 penanda cairan serebrospinal yang kami identifikasi dalam lima kelompok terkait dengan proses penyakit di korteks AD, termasuk yang terjadi pada tahap awal tanpa gejala.
Untuk menganalisis dengan lebih baik arah perubahan protein panel di otak dan cairan tulang belakang, kami menggambar yang berikut untuk masing-masing dari 15 modul yang tumpang tindih: (i) menemukan tingkat kelimpahan modul dalam kumpulan data otak dan (ii) modul protein Perbedaannya dinyatakan dalam cairan serebrospinal (Gambar S5). Seperti disebutkan sebelumnya, WGCNA digunakan untuk menentukan kelimpahan modul atau nilai karakteristik protein di otak (13). Peta gunung berapi digunakan untuk menggambarkan ekspresi diferensial protein modular dalam cairan serebrospinal (AD/kontrol). Angka-angka ini menunjukkan bahwa tiga dari lima panel menunjukkan tren ekspresi yang berbeda pada otak dan cairan tulang belakang. Dua modul panel sinapsis (M1 dan M12) menunjukkan penurunan tingkat kelimpahan di otak AD, namun secara signifikan tumpang tindih dengan peningkatan protein di CSF AD (Gambar S5A). Modul terkait neuron yang mengandung metabolom (M3 dan M38) menunjukkan pola ekspresi otak dan cairan serebrospinal yang serupa dan tidak konsisten (Gambar S5E). Panel vaskular juga menunjukkan tren ekspresi yang berbeda, meskipun modulnya (M6 dan M15) meningkat secara moderat pada otak AD dan menurun pada CSF yang sakit (Gambar S5B). Dua panel sisanya berisi jaringan glial besar yang proteinnya secara konsisten diatur ke atas di kedua kompartemen (Gambar S5, C dan D).
Harap perhatikan bahwa tren ini tidak umum terjadi pada semua penanda di panel ini. Misalnya, panel sinaptik mencakup beberapa protein yang berkurang secara signifikan di otak AD dan CSF (Gambar S5A). Di antara penanda cairan serebrospinal yang diatur ke bawah ini adalah NPTX2 dan VGF dari M1, dan kromogranin B dari M12. Namun, terlepas dari pengecualian ini, sebagian besar penanda sinaptik kami meningkat pada cairan tulang belakang AD. Secara keseluruhan, analisis ini mampu membedakan tren yang signifikan secara statistik pada tingkat otak dan cairan serebrospinal di masing-masing lima panel kami. Tren ini menyoroti hubungan yang kompleks dan seringkali berbeda antara ekspresi protein otak dan CSF pada DA.
Kemudian, kami menggunakan analisis replikasi MS throughput tinggi (replikasi CSF 1) untuk mempersempit 271 kumpulan biomarker kami menjadi target yang paling menjanjikan dan dapat direproduksi (Gambar 5A). Salinan CSF 1 berisi total 96 sampel dari Emory Goizueta ADRC, termasuk kohort kontrol, AsymAD, dan AD (Tabel S1A). Kasus-kasus DA ini ditandai dengan penurunan kognitif ringan (rata-rata MoCA, 20,0 ± 3,8), dan perubahan biomarker AD dikonfirmasi dalam cairan serebrospinal (Tabel S1A). Bertentangan dengan analisis CSF yang kami temukan, replikasi ini dilakukan menggunakan metode MS “single-shot” yang lebih efisien dan throughput tinggi (tanpa fraksinasi offline), termasuk protokol persiapan sampel yang disederhanakan yang menghilangkan kebutuhan akan penipisan imun pada masing-masing sampel. . Sebaliknya, satu “saluran peningkat” yang kehabisan kekebalan digunakan untuk memperkuat sinyal protein yang jumlahnya lebih sedikit (37). Meskipun mengurangi cakupan proteom total, metode single-shot ini secara signifikan mengurangi waktu mesin dan meningkatkan jumlah sampel berlabel TMT yang dapat dianalisis secara layak (17, 38). Secara total, analisis tersebut mengidentifikasi 6.487 peptida, yang dipetakan menjadi 1.183 proteom dalam 96 kasus. Seperti analisis CSF yang kami temukan, hanya protein yang dihitung dalam setidaknya 50% sampel yang dimasukkan dalam perhitungan selanjutnya, dan data tersebut diregresi untuk mengetahui dampak usia dan jenis kelamin. Hal ini mengarah pada kuantifikasi akhir dari 792 proteom, 95% di antaranya juga diidentifikasi dalam kumpulan data CSF yang ditemukan.
(A) Target protein CSF terkait otak diverifikasi dalam replikasi kohort CSF pertama dan dimasukkan dalam panel akhir (n = 60). (B ke E) Tingkat biomarker panel (skor z gabungan) diukur dalam empat kelompok replikasi CSF. Uji-t berpasangan atau ANOVA dengan pasca-koreksi Tukey digunakan untuk mengevaluasi signifikansi statistik dari perubahan kelimpahan dalam setiap analisis ulangan. CT, kontrol.
Karena kami secara khusus tertarik untuk memverifikasi 271 target CSF terkait otak melalui analisis komprehensif, kami akan membatasi pemeriksaan lebih lanjut terhadap proteom yang direplikasi ini pada penanda-penanda ini. Di antara 271 protein ini, 100 terdeteksi dalam replikasi CSF 1. Gambar S6A menunjukkan ekspresi diferensial dari 100 penanda yang tumpang tindih antara sampel replikasi kontrol dan AD. Histon sinaptik dan metabolit meningkat paling besar pada DA, sedangkan protein vaskular paling menurun pada penyakit. Sebagian besar dari 100 penanda yang tumpang tindih (n = 70) mempertahankan arah perubahan yang sama pada dua kumpulan data (Gambar S6B). 70 penanda CSF terkait otak yang tervalidasi ini (Tabel S2H) sebagian besar mencerminkan tren ekspresi panel yang diamati sebelumnya, yaitu penurunan regulasi protein vaskular dan peningkatan regulasi semua panel lainnya. Hanya 10 dari 70 protein yang divalidasi menunjukkan perubahan kelimpahan AD yang bertentangan dengan tren panel ini. Untuk menghasilkan panel yang paling mencerminkan tren keseluruhan otak dan cairan serebrospinal, kami mengecualikan 10 protein ini dari panel yang akhirnya kami verifikasi (Gambar 5A). Oleh karena itu, panel kami pada akhirnya mencakup total 60 protein yang diverifikasi dalam dua kohort CSF AD independen menggunakan persiapan sampel dan analisis platform MS yang berbeda. Plot ekspresi skor-z dari panel akhir ini pada kontrol salinan 1 CSF dan kasus AD mengkonfirmasi tren panel yang diamati pada kohort CSF yang kami temukan (Gambar 5B).
Di antara 60 protein ini, terdapat molekul yang diketahui berhubungan dengan DA, seperti osteopontin (SPP1), yang merupakan sitokin pro-inflamasi yang telah dikaitkan dengan DA dalam banyak penelitian (39-41), dan GAP43, Sebuah protein sinaptik. yang jelas terkait dengan degenerasi saraf (42). Protein yang paling terverifikasi sepenuhnya adalah penanda yang terkait dengan penyakit neurodegeneratif lainnya, seperti amyotrophic lateral sclerosis (ALS) terkait superoksida dismutase 1 (SOD1) dan desaccharase terkait penyakit Parkinson (PARK7). Kami juga telah memverifikasi bahwa banyak penanda lain, seperti SMOC1 dan protein pensinyalan lampiran membran kaya otak 1 (BASP1), telah membatasi hubungan sebelumnya dengan degenerasi saraf. Perlu dicatat bahwa karena rendahnya kelimpahan keseluruhannya dalam proteom CSF, sulit bagi kita untuk menggunakan metode deteksi single-shot throughput tinggi ini untuk mendeteksi MAPT dan protein tertentu terkait AD lainnya (misalnya, NEFL dan NRGN). ) ( 43, 44).
Kami kemudian memeriksa 60 penanda panel prioritas ini dalam tiga analisis ulangan tambahan. Dalam CSF Copy 2, kami menggunakan TMT-MS tunggal untuk menganalisis kohort independen dari 297 sampel kontrol dan AD dari Emory Goizueta ADRC (17). Replikasi CSF 3 mencakup analisis ulang data TMT-MS yang tersedia dari 120 pasien kontrol dan AD dari Lausanne, Swiss (45). Kami mendeteksi lebih dari dua pertiga dari 60 penanda prioritas di setiap kumpulan data. Meskipun penelitian di Swiss menggunakan platform MS dan metode kuantifikasi TMT yang berbeda (45, 46), kami mereproduksi tren panel kami dengan kuat dalam dua analisis berulang (Gambar 5, C dan D, dan Tabel S2, I, dan J). Untuk mengevaluasi spesifisitas penyakit pada kelompok kami, kami menggunakan TMT-MS untuk menganalisis kumpulan data replikasi keempat (replikasi CSF 4), yang mencakup tidak hanya kasus kontrol (n = 18) dan AD (n = 17), tetapi juga PD ( n = 14)), sampel ALS (n = 18) dan demensia frontotemporal (FTD) (n = 11) (Tabel S1A). Kami berhasil menghitung hampir dua pertiga protein panel dalam kelompok ini (38 dari 60). Hasil ini menyoroti perubahan spesifik AD di kelima panel biomarker (Gambar 5E dan Tabel S2K). Peningkatan pada kelompok metabolit menunjukkan spesifisitas AD paling kuat, disusul kelompok mielinisasi dan glial. Pada tingkat yang lebih rendah, FTD juga menunjukkan peningkatan di antara panel-panel ini, yang mungkin mencerminkan potensi perubahan jaringan yang serupa (17). Sebaliknya, ALS dan PD menunjukkan profil mielinisasi, glial, dan metabolom yang hampir sama dengan kelompok kontrol. Secara keseluruhan, meskipun ada perbedaan dalam persiapan sampel, platform MS, dan metode kuantifikasi TMT, analisis berulang ini menunjukkan bahwa penanda panel prioritas kami memiliki perubahan spesifik AD yang sangat konsisten di lebih dari 500 sampel CSF unik.
Degenerasi saraf AD telah diketahui secara luas beberapa tahun sebelum timbulnya gejala kognitif, sehingga terdapat kebutuhan mendesak akan biomarker AsymAD (5, 31). Namun, semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa biologi AsymAD jauh dari homogen, dan interaksi kompleks antara risiko dan ketahanan menyebabkan perbedaan besar pada perkembangan penyakit selanjutnya pada setiap individu (47). Meskipun digunakan untuk mengidentifikasi kasus AsymAD, tingkat biomarker inti CSF (Aβ1-42, total tau dan p-tau) belum terbukti dapat memprediksi secara andal siapa yang akan berkembang menjadi demensia (4, 7), yang menunjukkan lebih banyak lagi. perlu untuk menyertakan alat biomarker holistik berdasarkan berbagai aspek fisiologi otak untuk membuat stratifikasi risiko populasi ini secara akurat. Oleh karena itu, kami kemudian menganalisis panel biomarker kami yang divalidasi AD pada populasi AsymAD dari salinan CSF 1. 31 kasus AsymAD ini menunjukkan tingkat biomarker inti yang abnormal (rasio Aβ1–42/total tau ELISA, <5,5) dan kognisi lengkap (rata-rata MoCA, 27,1 ± 2.2) (Tabel S1A). Selain itu, semua individu dengan AsymAD memiliki skor demensia klinis 0, yang menunjukkan bahwa tidak ada bukti penurunan kinerja kognitif atau fungsional harian.
Kami pertama-tama menganalisis level panel yang divalidasi di 96 replikasi CSF 1, termasuk kohort AsymAD. Kami menemukan bahwa beberapa panel pada kelompok AsymAD memiliki perubahan kelimpahan mirip AD yang signifikan, panel vaskular menunjukkan tren penurunan pada AsymAD, sementara semua panel lainnya menunjukkan tren peningkatan (Gambar 6A). Oleh karena itu, semua panel menunjukkan korelasi yang sangat signifikan dengan ELISA Aβ1-42 dan kadar tau total (Gambar 6B). Sebaliknya, korelasi antara kelompok dan skor MoCA relatif buruk. Salah satu temuan yang lebih mencolok dari analisis ini adalah banyaknya panel yang melimpah pada kelompok AsymAD. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6A, level panel grup AsymAD biasanya melintasi level panel grup kontrol dan grup AD, sehingga menunjukkan variabilitas yang relatif tinggi. Untuk mengeksplorasi lebih jauh heterogenitas AsymAD ini, kami menerapkan analisis Multidimensional Scaling (MDS) pada 96 kasus replikasi CSF 1. Analisis MDS memungkinkan untuk memvisualisasikan kesamaan antar kasus berdasarkan variabel tertentu dalam kumpulan data. Untuk analisis klaster ini, kami hanya menggunakan penanda panel tervalidasi yang memiliki perubahan signifikan secara statistik (P <0,05, AD/kontrol) pada tingkat penemuan dan replikasi 1 CSF proteome (n = 29) (Tabel S2L). Analisis ini menghasilkan pengelompokan spasial yang jelas antara kontrol kami dan kasus AD (Gambar 6C). Sebaliknya, beberapa kasus AsymAD secara jelas dikelompokkan dalam kelompok kontrol, sementara yang lain berada dalam kasus AD. Untuk mengeksplorasi lebih jauh heterogenitas AsymAD ini, kami menggunakan peta MDS untuk mendefinisikan dua kelompok kasus AsymAD ini. Kelompok pertama mencakup kasus-kasus AsymAD yang berkerumun lebih dekat dengan kontrol (n = 19), sedangkan kelompok kedua ditandai oleh kasus-kasus AsymAD dengan profil penanda yang lebih dekat dengan AD (n = 12).
(A) Tingkat ekspresi (skor-z) kelompok biomarker CSF di seluruh 96 sampel dalam kelompok replikasi CSF 1, termasuk AsymAD. Analisis varians dengan pasca-koreksi Tukey digunakan untuk mengevaluasi signifikansi statistik perubahan kelimpahan panel. (B) Analisis korelasi tingkat kelimpahan protein panel (z-score) dengan skor MoCA dan kadar tau total pada sampel ELISA Aβ1-42 dan CSF copy 1. Koefisien korelasi Pearson dengan nilai P yang relevan ditampilkan. (C) MDS dari 96 kasus salinan 1 CSF didasarkan pada tingkat kelimpahan dari 29 penanda panel yang divalidasi, yang berubah secara signifikan baik dalam kumpulan data penemuan maupun salinan CSF 1 [P <0,05 AD/kontrol (CT)]. Analisis ini digunakan untuk membagi kelompok AsymAD menjadi subkelompok kontrol (n = 19) dan AD (n = 12). (D) Plot gunung berapi menunjukkan ekspresi diferensial dari semua protein replikasi 1 CSF dengan perubahan kali lipat log2 (sumbu x) relatif terhadap nilai P statistik -log10 antara dua subkelompok AsymAD. Biomarker panel berwarna. (E) Replikasi CSF 1 tingkat kelimpahan biomarker kelompok seleksi diekspresikan secara berbeda antara subkelompok AsymAD. Analisis varians pasca-penyesuaian Tukey digunakan untuk menilai signifikansi statistik.
Kami memeriksa perbedaan ekspresi protein antara kontrol ini dan kasus AsymAD seperti AD (Gambar 6D dan Tabel S2L). Peta gunung berapi yang dihasilkan menunjukkan bahwa 14 panel penanda telah berubah secara signifikan antara kedua kelompok. Sebagian besar penanda ini adalah anggota sinapsis dan metabolom. Namun, SOD1 dan substrat protein kinase C kaya alanin myristoylated (MARCKS), yang masing-masing merupakan anggota kelompok imun mielin dan glial, juga termasuk dalam kelompok ini (Gambar 6, D dan E). Panel vaskular juga menyumbangkan dua penanda yang berkurang secara signifikan pada kelompok AsymAD mirip AD, termasuk protein pengikat AE 1 (AEBP1) dan anggota keluarga pelengkap C9. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara subkelompok kontrol dan subkelompok AsymAD mirip AD pada ELISA AB1-42 (P = 0,38) dan p-tau (P = 0,28), tetapi memang terdapat perbedaan yang signifikan pada kadar tau total (P = 0,0031 ) (Gbr. S7). Ada beberapa penanda panel yang menunjukkan bahwa perubahan antara dua subkelompok AsymAD lebih signifikan daripada total tingkat tau (misalnya, YWHAZ, SOD1, dan MDH1) (Gambar 6E). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa panel kami yang tervalidasi mungkin berisi biomarker yang dapat melakukan subtipe dan stratifikasi risiko potensial pada pasien dengan penyakit tanpa gejala.
Terdapat kebutuhan mendesak akan alat biomarker berbasis sistem untuk mengukur dan menargetkan berbagai patofisiologi di balik DA dengan lebih baik. Alat-alat ini diharapkan tidak hanya mengubah kerangka diagnostik AD kami, namun juga mendorong penerapan strategi pengobatan yang efektif dan spesifik untuk pasien (1, 2). Untuk tujuan ini, kami menerapkan pendekatan proteomik komprehensif yang tidak memihak pada otak AD dan CSF untuk mengidentifikasi biomarker CSF berbasis web yang mencerminkan berbagai patofisiologi berbasis otak. Analisis kami menghasilkan lima panel biomarker CSF, yang (i) mencerminkan sinapsis, pembuluh darah, mielin, disfungsi kekebalan dan metabolisme; (ii) menunjukkan reproduktifitas yang kuat pada platform MS yang berbeda; (iii) Menunjukkan perubahan spesifik penyakit yang progresif sepanjang tahap awal dan akhir DA. Secara keseluruhan, temuan ini mewakili langkah yang menjanjikan menuju pengembangan alat biomarker yang beragam, andal, dan berorientasi web untuk penelitian AD dan aplikasi klinis.
Hasil kami menunjukkan organisasi proteom jaringan otak AD yang sangat terpelihara dan mendukung penggunaannya sebagai jangkar untuk pengembangan biomarker berbasis sistem. Analisis kami menunjukkan bahwa dua kumpulan data TMT-MS independen yang berisi otak AD dan AsymAD memiliki modularitas yang kuat. Temuan ini memperluas penelitian kami sebelumnya, menunjukkan pelestarian modul kuat di lebih dari 2.000 jaringan otak dari berbagai kelompok independen di korteks frontal, parietal, dan temporal (17). Jaringan konsensus ini mencerminkan berbagai perubahan terkait penyakit yang diamati dalam penelitian saat ini, termasuk peningkatan modul inflamasi kaya glial dan penurunan modul kaya neuron. Seperti penelitian saat ini, jaringan berskala besar ini juga menampilkan perubahan modular yang signifikan pada AsymAD, yang menunjukkan berbagai patofisiologi praklinis yang berbeda (17).
Namun, dalam kerangka berbasis sistem yang sangat konservatif ini, terdapat heterogenitas biologis yang lebih mendalam, terutama di antara individu pada tahap awal DA. Panel biomarker kami mampu menggambarkan dua subkelompok di AsymAD, yang menunjukkan perbedaan ekspresi signifikan dari beberapa penanda CSF. Kelompok kami dapat menyoroti perbedaan biologis antara kedua subkelompok ini, yang tidak terlihat jelas pada tingkat biomarker inti AD. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, rasio Aβ1-42/total tau dari individu AsymAD ini sangat rendah. Namun, hanya total level tau yang berbeda secara signifikan antara dua subkelompok AsymAD, sedangkan level Aβ1-42 dan p-tau tetap relatif sebanding. Karena tau CSF yang tinggi tampaknya menjadi prediktor gejala kognitif yang lebih baik daripada tingkat Aβ1-42 (7), kami menduga bahwa kedua kelompok AsymAD mungkin memiliki risiko perkembangan penyakit yang berbeda. Mengingat terbatasnya ukuran sampel AsymAD kami dan kurangnya data longitudinal, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menarik kesimpulan ini dengan yakin. Namun, hasil ini menunjukkan bahwa panel CSF berbasis sistem dapat meningkatkan kemampuan kita untuk membuat stratifikasi individu secara efektif selama tahap penyakit tanpa gejala.
Secara keseluruhan, temuan kami mendukung peran berbagai fungsi biologis dalam patogenesis DA. Namun, metabolisme energi yang tidak teratur menjadi tema utama dari kelima panel pelabelan kami yang tervalidasi. Protein metabolik, seperti hipoksantin-guanin fosforibosiltransferase 1 (HPRT1) dan laktat dehidrogenase A (LDHA), adalah biomarker sinaptik yang paling tervalidasi, menunjukkan bahwa peningkatan AD CSF adalah jenis kelamin yang sangat dapat direproduksi. Pembuluh darah dan panel glial kita juga mengandung beberapa penanda yang terlibat dalam metabolisme zat oksidatif. Temuan ini konsisten dengan peran kunci proses metabolisme di seluruh otak, tidak hanya untuk memenuhi kebutuhan energi neuron yang tinggi, tetapi juga untuk memenuhi kebutuhan energi astrosit dan sel glial lainnya yang tinggi (17, 48). Hasil kami mendukung semakin banyak bukti bahwa perubahan potensi redoks dan gangguan jalur energi mungkin merupakan hubungan inti antara beberapa proses utama yang terlibat dalam patogenesis DA, termasuk gangguan mitokondria, peradangan yang dimediasi glial, dan kerusakan pembuluh darah (49). Selain itu, biomarker cairan serebrospinal metabolik mengandung sejumlah besar protein kaya yang berbeda antara kontrol kami dan subkelompok AsymAD seperti AD, menunjukkan bahwa gangguan jalur energi dan redoks ini mungkin sangat penting dalam tahap praklinis penyakit ini.
Perbedaan tren panel otak dan cairan serebrospinal yang kami amati juga memiliki implikasi biologis yang menarik. Sinapsis dan metabolom yang kaya akan neuron menunjukkan penurunan kadar AD di otak dan peningkatan kelimpahan cairan serebrospinal. Mengingat bahwa neuron kaya akan mitokondria penghasil energi di sinapsis untuk menyediakan energi bagi banyak sinyal khusus mereka (50), diharapkan ada kesamaan profil ekspresi kedua kelompok neuron ini. Hilangnya neuron dan ekstrusi sel-sel yang rusak dapat menjelaskan tren panel otak dan CSF pada penyakit selanjutnya, namun tidak dapat menjelaskan perubahan panel awal yang kita amati (13). Salah satu penjelasan yang mungkin untuk temuan ini pada penyakit awal tanpa gejala adalah pemangkasan sinaptik yang abnormal. Bukti baru pada model tikus menunjukkan bahwa fagositosis sinaptik yang dimediasi mikroglia mungkin teraktivasi secara abnormal pada DA dan menyebabkan hilangnya sinapsis dini di otak (51). Materi sinaptik yang dibuang ini dapat terakumulasi di CSF, itulah sebabnya kami mengamati peningkatan CSF di panel neuron. Pemangkasan sinaptik yang dimediasi kekebalan juga dapat menjelaskan sebagian peningkatan protein glial yang kita amati di otak dan cairan serebrospinal selama proses penyakit. Selain pemangkasan sinaptik, kelainan keseluruhan pada jalur eksositik juga dapat menyebabkan perbedaan ekspresi penanda saraf di otak dan CSF. Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa kandungan eksosom dalam patogenesis otak DA telah berubah (52). Jalur ekstraseluler juga terlibat dalam proliferasi Aβ (53, 54). Perlu dicatat bahwa penekanan sekresi eksosom dapat mengurangi patologi mirip AD pada model tikus transgenik AD (55).
Pada saat yang sama, protein pada panel vaskular menunjukkan peningkatan moderat pada otak AD, namun menurun secara signifikan pada CSF. Disfungsi penghalang darah-otak (BBB) sebagian dapat menjelaskan temuan ini. Banyak penelitian postmortem independen pada manusia telah menunjukkan kerusakan BBB pada AD (56, 57). Studi-studi ini mengkonfirmasi berbagai aktivitas abnormal di sekitar lapisan sel endotel yang tertutup rapat ini, termasuk kebocoran kapiler otak dan akumulasi protein yang dibawa melalui darah di perivaskular (57). Hal ini dapat memberikan penjelasan sederhana untuk peningkatan protein pembuluh darah di otak, namun tidak dapat sepenuhnya menjelaskan penipisan protein yang sama dalam cairan serebrospinal. Salah satu kemungkinannya adalah sistem saraf pusat secara aktif mengisolasi molekul-molekul ini untuk mengatasi masalah peningkatan peradangan dan stres oksidatif. Pengurangan beberapa protein CSF yang paling parah dalam panel ini, terutama yang terlibat dalam regulasi lipoprotein, berkaitan dengan penghambatan tingkat peradangan yang berbahaya dan proses neuroprotektif spesies oksigen reaktif. Hal ini berlaku untuk Paroxonase 1 (PON1), suatu enzim pengikat lipoprotein yang bertanggung jawab untuk mengurangi tingkat stres oksidatif dalam sirkulasi (58, 59). Prekursor alfa-1-mikroglobulin/bikunin (AMBP) adalah penanda kelompok vaskular yang mengalami penurunan regulasi secara signifikan. Ini adalah prekursor bikunin pengangkut lipid, yang juga terlibat dalam penekanan peradangan dan perlindungan neurologis (60, 61).
Terlepas dari berbagai hipotesis yang menarik, ketidakmampuan untuk mendeteksi secara langsung mekanisme penyakit biokimia merupakan keterbatasan analisis proteomik yang didorong oleh penemuan. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan mekanisme di balik panel biomarker ini. Untuk bergerak menuju pengembangan analisis klinis berbasis MS, arah masa depan juga memerlukan penggunaan metode kuantitatif yang ditargetkan untuk verifikasi biomarker skala besar, seperti pemantauan reaksi selektif atau paralel (62). Kami baru-baru ini menggunakan pemantauan reaksi paralel (63) untuk memvalidasi banyak perubahan protein CSF yang dijelaskan di sini. Beberapa target panel prioritas diukur dengan akurasi yang signifikan, termasuk YWHAZ, ALDOA, dan SMOC1, yang masing-masing dipetakan ke panel sinapsis, metabolisme, dan peradangan (63). Akuisisi Data Independen (DIA) dan strategi berbasis MS lainnya mungkin juga berguna untuk verifikasi target. Bud dkk. (64) Baru-baru ini ditunjukkan bahwa terdapat tumpang tindih yang signifikan antara biomarker AD yang diidentifikasi dalam kumpulan data penemuan CSF kami dan kumpulan data independen DIA-MS, yang terdiri dari hampir 200 sampel CSF dari tiga kelompok Eropa yang berbeda. Studi terbaru ini mendukung potensi panel kami untuk bertransformasi menjadi deteksi berbasis MS yang andal. Deteksi berbasis antibodi dan aptamer tradisional juga penting untuk pengembangan lebih lanjut biomarker utama AD. Karena rendahnya kelimpahan CSF, lebih sulit untuk mendeteksi biomarker ini menggunakan metode MS throughput tinggi. NEFL dan NRGN adalah dua contoh biomarker CSF dengan kelimpahan rendah, yang dipetakan ke panel dalam analisis komprehensif kami, namun tidak dapat dideteksi secara andal menggunakan strategi MS tunggal kami. Strategi penargetan berdasarkan beberapa antibodi, seperti PEA, dapat mendorong transformasi klinis dari penanda ini.
Secara keseluruhan, penelitian ini memberikan pendekatan proteomik yang unik untuk identifikasi dan verifikasi biomarker CSF AD berdasarkan sistem yang berbeda. Mengoptimalkan panel penanda ini di seluruh kelompok AD tambahan dan platform MS mungkin terbukti menjanjikan untuk memajukan stratifikasi dan pengobatan risiko AD. Studi yang mengevaluasi tingkat longitudinal panel-panel ini dari waktu ke waktu juga penting untuk menentukan kombinasi penanda mana yang paling baik dalam menentukan stratifikasi risiko penyakit dini dan perubahan keparahan penyakit.
Kecuali 3 sampel yang disalin oleh CSF, seluruh sampel CSF yang digunakan dalam penelitian ini dikumpulkan di bawah naungan Emory ADRC atau lembaga penelitian yang terkait erat. Sebanyak empat set sampel Emory CSF digunakan dalam studi proteomik ini. Kohort CSF ditemukan berisi sampel dari 20 kontrol sehat dan 20 pasien AD. Salinan CSF 1 mencakup sampel dari 32 kontrol sehat, 31 individu AsymAD, dan 33 individu AD. Salinan CSF 2 berisi 147 kontrol dan 150 sampel AD. Replikasi CSF multi-penyakit 4 kohort mencakup 18 sampel kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, dan 11 FTD. Menurut perjanjian yang disetujui oleh Dewan Peninjau Kelembagaan Universitas Emory, semua peserta studi Emory memperoleh persetujuan. Menurut Pedoman Praktik Terbaik Institut Penuaan Nasional untuk Pusat Alzheimer tahun 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cairan serebrospinal dikumpulkan dan disimpan melalui pungsi lumbal. Pasien Kontrol dan AsymAD dan AD menerima penilaian kognitif standar di Emory Cognitive Neurology Clinic atau Goizueta ADRC. Sampel cairan serebrospinal mereka diuji dengan INNO-BIA AlzBio3 Luminex untuk ELISA Aβ1-42, analisis total tau dan p-tau (65). Nilai ELISA digunakan untuk mendukung klasifikasi diagnostik subjek berdasarkan kriteria batas biomarker AD yang ditetapkan (66, 67). Data demografi dan diagnostik dasar untuk diagnosis CSF lainnya (FTD, ALS, dan PD) juga diperoleh dari Emory ADRC atau lembaga penelitian afiliasinya. Ringkasan metadata kasus untuk kasus Emory CSF ini dapat ditemukan di Tabel S1A. Karakteristik kohort replikasi CSF Swiss 3 telah dipublikasikan sebelumnya (45).
CSF menemukan sampelnya. Untuk meningkatkan kedalaman penemuan kumpulan data CSF kami, konsumsi kekebalan terhadap protein berlimpah dilakukan sebelum trypsinization. Singkatnya, 130 μl CSF dari 40 sampel CSF individu dan volume yang sama (130 μl) Resin Penipisan Protein Kelimpahan Top14 Pilihan Tinggi (Thermo Fisher Scientific, A36372) ditempatkan dalam kolom putar (Thermo Fisher Scientific, A89868) di kamar suhu Inkubasi). Setelah diputar selama 15 menit, sentrifugasi sampel pada 1000g selama 2 menit. Perangkat filter ultrasentrifugal 3K (Millipore, UFC500396) digunakan untuk memekatkan sampel limbah dengan melakukan sentrifugasi pada 14.000 g selama 30 menit. Encerkan semua volume sampel hingga 75 μl dengan larutan buffer fosfat. Konsentrasi protein dievaluasi dengan metode asam bicinchoninic (BCA) sesuai dengan protokol pabrikan (Thermo Fisher Scientific). CSF yang immunodepleted (60 μl) dari 40 sampel dicerna dengan lisil endopeptidase (LysC) dan trypsin. Singkatnya, sampel direduksi dan dialkilasi dengan 1,2 μl 0,5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine dan 3 μl 0,8 M chloroacetamide pada 90°C selama 10 menit, dan kemudian disonikasi dalam penangas air selama 15 menit. Sampel diencerkan dengan 193 μl 8 M urea buffer [8 M urea dan 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] hingga konsentrasi akhir 6 M urea. LysC (4,5 μg; Wako) digunakan untuk pencernaan semalaman pada suhu kamar. Sampel kemudian diencerkan menjadi 1 M urea dengan 50 mM amonium bikarbonat (ABC) (68). Tambahkan trypsin (Promega) dalam jumlah yang sama (4,5 μg), lalu inkubasi sampel selama 12 jam. Asamkan larutan peptida yang telah dicerna hingga konsentrasi akhir 1% asam format (FA) dan 0,1% asam trifluoroasetat (TFA) (66), lalu hilangkan garam dengan kolom Sep-Pak C18 50 mg (Air) seperti dijelaskan di atas (25) . Peptida kemudian dielusi dalam 1 ml asetonitril 50% (ACN). Untuk membakukan kuantifikasi protein di seluruh kelompok (25), 100 μl alikuot dari seluruh 40 sampel CSF digabungkan untuk menghasilkan sampel campuran, yang kemudian dibagi menjadi lima sampel standar internal global (GIS) (48). Semua sampel individu dan standar gabungan dikeringkan dengan vakum berkecepatan tinggi (Labconco).
CSF menyalin sampel. Dayon dan rekannya sebelumnya telah menjelaskan penipisan kekebalan dan pencernaan sampel salinan 3 CSF (45, 46). Sampel ulangan yang tersisa tidak mengalami deplesi imun secara individual. Cerna sampel yang belum dihilangkan ini dalam trypsin seperti dijelaskan sebelumnya (17). Untuk setiap analisis berulang, 120 μl alikuot peptida yang dielusi dari masing-masing sampel dikumpulkan bersama dan dibagi menjadi alikuot dengan volume yang sama untuk digunakan sebagai standar internal global berlabel TMT (48). Semua sampel individu dan standar gabungan dikeringkan dengan vakum berkecepatan tinggi (Labconco). Untuk meningkatkan sinyal protein CSF dengan kelimpahan rendah, dengan menggabungkan 125 μl dari setiap sampel, sampel yang “ditingkatkan” disiapkan untuk setiap analisis ulangan [yaitu, sampel biologis yang meniru sampel penelitian, tetapi jumlah yang tersedia adalah jauh lebih besar (37, 69)] digabungkan menjadi sampel CSF campuran (17). Sampel campuran kemudian diimunisasi menggunakan 12 ml Resin Penghilang Protein Kelimpahan Top14 Pilihan Tinggi (Thermo Fisher Scientific, A36372), dicerna seperti dijelaskan di atas, dan dimasukkan dalam beberapa pelabelan TMT berikutnya.
Waktu posting: 27 Agustus-2021