Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Termofil adalah mikroorganisme yang tumbuh subur pada suhu tinggi. Mempelajarinya dapat memberikan informasi berharga tentang bagaimana kehidupan beradaptasi dengan kondisi ekstrem. Namun, sulit untuk mencapai kondisi suhu tinggi dengan mikroskop optik konvensional. Beberapa solusi buatan sendiri berdasarkan pemanasan listrik resistif lokal telah diusulkan, namun tidak ada solusi komersial yang sederhana. Dalam makalah ini, kami memperkenalkan konsep pemanasan laser skala mikro pada bidang pandang mikroskop untuk memberikan suhu tinggi untuk studi termofil sekaligus menjaga lingkungan pengguna tetap sejuk. Pemanasan skala mikro dengan intensitas laser sedang dapat dicapai dengan menggunakan substrat berlapis nanopartikel emas sebagai penyerap cahaya yang biokompatibel dan efisien. Kemungkinan efek konveksi cairan skala mikro, retensi sel, dan gerakan termoforesis sentrifugal dibahas. Metode ini telah dibuktikan pada dua spesies: (i) Geobacillus stearothermophilus, bakteri termofilik aktif yang berkembang biak pada suhu sekitar 65°C, yang telah kami amati berkecambah, tumbuh dan berenang di bawah pemanasan skala mikro; (ii) Thiobacillus sp., archaea hipertermofilik optimal. pada suhu 80°C. Pekerjaan ini membuka jalan bagi pengamatan mikroorganisme termofilik yang sederhana dan aman menggunakan alat mikroskop modern dan terjangkau.
Selama miliaran tahun, kehidupan di Bumi telah berevolusi untuk beradaptasi dengan berbagai kondisi lingkungan yang terkadang dianggap ekstrem dari sudut pandang manusia. Secara khusus, beberapa mikroorganisme termofilik (bakteri, archaea, jamur) yang disebut termofil tumbuh subur pada kisaran suhu dari 45°C hingga 122°C1, 2, 3, 4. Termofil hidup di berbagai ekosistem, seperti ventilasi hidrotermal laut dalam, sumber air panas. atau daerah vulkanik. Penelitian mereka telah menarik banyak perhatian selama beberapa dekade terakhir karena setidaknya dua alasan. Pertama, kita dapat belajar darinya, misalnya, bagaimana termofil 5, 6, enzim 7, 8 dan membran 9 stabil pada suhu tinggi, atau bagaimana termofil dapat menahan tingkat radiasi yang ekstrim10. Kedua, mereka adalah dasar bagi banyak aplikasi bioteknologi penting1,11,12 seperti produksi bahan bakar13,14,15,16, sintesis kimia (dihidro, alkohol, metana, asam amino, dll.)17, biomining18 dan biokatalis termostabil7 ,11, 13. Secara khusus, reaksi berantai polimerase (PCR)19 yang terkenal saat ini melibatkan enzim (Taq polimerase) yang diisolasi dari bakteri termofilik Thermus Aquaticus, salah satu termofil pertama yang ditemukan.
Namun, studi tentang termofil bukanlah tugas yang mudah dan tidak dapat dilakukan di laboratorium biologi mana pun. Secara khusus, termofil hidup tidak dapat diamati secara in vitro dengan mikroskop cahaya standar apa pun, bahkan dengan ruang pemanas yang tersedia secara komersial, yang biasanya memiliki suhu serendah 40°C. Sejak tahun 1990an, hanya sedikit kelompok penelitian yang mendedikasikan diri mereka pada pengenalan sistem mikroskop suhu tinggi (HTM). Pada tahun 1994 Glukh dkk. Ruang pemanas/pendingin dirancang berdasarkan penggunaan sel Peltier yang mengontrol suhu kapiler persegi panjang yang tertutup untuk menjaga anaerobitas 20 . Perangkat ini dapat dipanaskan hingga 100 °C dengan kecepatan 2 °C/s, sehingga penulis dapat mempelajari motilitas bakteri hipertermofilik Thermotoga maritima21. Pada tahun 1999 Horn dkk. Perangkat yang sangat mirip telah dikembangkan, masih berdasarkan penggunaan kapiler panas yang cocok untuk mikroskop komersial untuk mempelajari pembelahan/koneksi sel. Setelah relatif lama tidak aktif, pencarian HTM yang efektif dilanjutkan pada tahun 2012, khususnya sehubungan dengan serangkaian makalah oleh kelompok Wirth yang menggunakan perangkat yang ditemukan oleh Horn dkk. Lima belas tahun yang lalu, motilitas sejumlah besar archaea, termasuk hipertermofil, dipelajari pada suhu hingga 100°C menggunakan kapiler yang dipanaskan23,24. Mereka juga memodifikasi mikroskop asli untuk mencapai pemanasan yang lebih cepat (beberapa menit, bukan 35 menit untuk mencapai suhu yang disetel) dan mencapai gradien suhu linier lebih dari 2 cm melintasi medium. Perangkat pembentuk gradien suhu (TGFD) ini telah digunakan untuk mempelajari mobilitas banyak termofil dalam gradien suhu pada jarak yang relevan secara biologis 24, 25 .
Memanaskan kapiler tertutup bukanlah satu-satunya cara untuk mengamati termofil hidup. Pada tahun 2012, Kuwabara dkk. Ruang Pyrex sekali pakai buatan sendiri yang disegel dengan perekat tahan panas (Super X2; Cemedine, Jepang) digunakan. Sampel ditempatkan pada pelat pemanas transparan yang tersedia secara komersial (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Jepang) yang mampu memanaskan hingga 110°C, namun awalnya tidak dimaksudkan untuk bioimaging. Para penulis mengamati pembelahan efisien bakteri termofilik anaerobik (Thermosipho globiformans, waktu penggandaan 24 menit) pada 65°C. Pada tahun 2020, Pulshen dkk. Pemanasan piring logam komersial yang efisien (AttofluorTM, Thermofisher) didemonstrasikan menggunakan dua elemen pemanas buatan sendiri: penutup dan panggung (konfigurasi yang terinspirasi dari mesin PCR). Asosiasi ini menghasilkan suhu cairan yang seragam dan mencegah penguapan dan kondensasi di bagian bawah tutupnya. Penggunaan O-ring menghindari pertukaran gas dengan lingkungan. HTM ini, yang disebut Sulfoscope, digunakan untuk menggambarkan Sulfolobus acidocaldarius pada suhu 75°C27.
Keterbatasan yang diakui dari semua sistem ini adalah pembatasan penggunaan sasaran udara, perendaman minyak apa pun tidak cocok untuk suhu tinggi dan untuk pencitraan melalui sampel transparan setebal >1 mm. Keterbatasan yang diakui dari semua sistem ini adalah pembatasan penggunaan sasaran udara, perendaman minyak apa pun tidak cocok untuk suhu tinggi dan untuk pencitraan melalui sampel transparan setebal >1 mm. Общепризнанныы недос 201 нное погрeda Kelemahan yang diketahui dari semua sistem ini adalah keterbatasan penggunaan sasaran udara, karena perendaman minyak apa pun tidak cocok untuk suhu setinggi itu dan untuk visualisasi melalui sampel transparan dengan ketebalan > 1 mm.> 1 毫米厚的透明样品成像。 Keterbatasan yang diakui dari semua sistem ini adalah keterbatasan penggunaan cermin yang mengandung udara, karena perendaman minyak apa pun tidak cocok untuk pencitraan sampel transparan dengan ketebalan >1 mm pada suhu tinggi. Anda tidak dapat melakukan hal ini dengan benar ya, ada banyak orang yang tidak tahu apa-apa tentang tema dan masalah yang mereka hadapi jumlah volume yang diperlukan >1 mm. Kelemahan yang diketahui dari semua sistem ini adalah terbatasnya penggunaan lensa udara, perendaman minyak apa pun tidak cocok untuk suhu tinggi dan visualisasi melalui sampel transparan dengan ketebalan >1 mm.Baru-baru ini, keterbatasan ini dicabut oleh Charles-Orzag dkk. 28, yang mengembangkan perangkat yang tidak lagi menyediakan panas di sekitar sistem yang diinginkan, melainkan di dalam kaca penutup itu sendiri, ditutupi dengan lapisan transparan tipis dari resistor yang terbuat dari ITO (indium-tin oxide). Tutupnya dapat dipanaskan hingga 75 °C dengan mengalirkan arus listrik melalui lapisan transparan. Namun penulis juga harus memanaskan lensa hingga mencapai suhu objektif, namun tidak lebih dari 65 °C, agar tidak merusaknya.
Karya-karya ini menunjukkan bahwa pengembangan mikroskop optik suhu tinggi yang efisien belum diadopsi secara luas, seringkali memerlukan peralatan buatan sendiri, dan sering kali dicapai dengan mengorbankan resolusi spasial, yang merupakan kerugian serius mengingat mikroorganisme termofilik tidak lebih besar dari beberapa. mikrometer. Mengurangi volume pemanasan adalah kunci untuk memecahkan tiga masalah yang melekat pada HTM: resolusi spasial yang buruk, inersia termal yang tinggi ketika sistem memanas, dan pemanasan berbahaya pada elemen di sekitarnya (minyak imersi, lensa objektif… atau tangan pengguna) pada suhu ekstrem. ).
Dalam makalah ini, kami memperkenalkan HTM untuk pengamatan termofil yang tidak didasarkan pada pemanasan resistif. Sebaliknya, kami mencapai pemanasan lokal dalam wilayah terbatas bidang pandang mikroskop dengan iradiasi laser pada substrat penyerap cahaya. Distribusi suhu divisualisasikan menggunakan mikroskop fase kuantitatif (QPM). Efektivitas metode ini ditunjukkan oleh Geobacillus stearothermophilus, bakteri termofilik motil yang berkembang biak pada suhu sekitar 65°C dan memiliki waktu penggandaan yang singkat (sekitar 20 menit), dan Sulfolobus shibatae, bakteri hipertermofil yang tumbuh optimal pada suhu 80°C (archaea) untuk mengilustrasikan. Tingkat replikasi normal dan renang diamati sebagai fungsi suhu. Laser HTM (LA-HTM) ini tidak dibatasi oleh ketebalan kaca penutup atau sifat tujuannya (perendaman udara atau minyak). Hal ini memungkinkan lensa resolusi tinggi apa pun yang ada di pasaran untuk digunakan. Ia juga tidak mengalami pemanasan lambat karena inersia termal (mencapai pemanasan instan dalam skala milidetik) dan hanya menggunakan komponen yang tersedia secara komersial. Satu-satunya masalah keamanan baru terkait dengan adanya sinar laser yang kuat (biasanya hingga 100 mW) di dalam perangkat dan mungkin melalui mata, sehingga memerlukan kacamata pelindung.
Prinsip LA-HTM adalah menggunakan laser untuk memanaskan sampel secara lokal dalam bidang pandang mikroskop (Gbr. 1a). Untuk melakukan ini, sampel harus menyerap cahaya. Untuk menggunakan daya laser yang masuk akal (kurang dari 100 mW), kami tidak mengandalkan penyerapan cahaya oleh media cair, namun secara artifisial meningkatkan penyerapan sampel dengan melapisi substrat dengan nanopartikel emas (Gbr. 1c). Memanaskan nanopartikel emas dengan cahaya merupakan hal yang sangat penting dalam bidang plasmonik termal, dengan penerapan yang diharapkan dalam biomedis, nanokimia, atau pemanenan sinar matahari29,30,31. Selama beberapa tahun terakhir, kami telah menggunakan LA-HTM ini dalam beberapa penelitian terkait aplikasi plasma termal dalam fisika, kimia, dan biologi. Kesulitan utama dalam metode ini adalah dalam menampilkan profil suhu akhir, karena peningkatan suhu terbatas pada wilayah skala mikro dalam sampel. Kami telah menunjukkan bahwa pemetaan suhu dapat dicapai dengan interferometer geser melintang empat panjang gelombang, metode mikroskop fase kuantitatif yang sederhana, beresolusi tinggi, dan sangat sensitif berdasarkan penggunaan kisi difraksi dua dimensi (juga dikenal sebagai kisi silang) 33,34,35,36. Keandalan teknik mikroskop termal ini, berdasarkan pada cross grating wavefront microscopy (CGM), telah dibuktikan dalam selusin makalah yang diterbitkan selama dekade terakhir37,38,39,40,41,42,43.
Skema pemasangan mikroskop laser pemanas, pembentukan dan suhu paralel. b Geometri sampel terdiri dari ruang AttofluorTM yang berisi kaca penutup yang dilapisi nanopartikel emas. c Perhatikan sampel dengan cermat (jangan menskalakannya). d mewakili profil sinar laser yang seragam dan (e) simulasi distribusi suhu selanjutnya pada bidang sampel nanopartikel emas. f adalah profil sinar laser berbentuk cincin yang cocok untuk menghasilkan suhu seragam seperti yang ditunjukkan dalam simulasi distribusi suhu yang dihasilkan pada (g). Bilah skala: 30 µm.
Secara khusus, kami baru-baru ini mencapai pemanasan sel mamalia dengan LA-HTM dan CGM dan melacak respons kejutan panas seluler dalam kisaran 37-42°C, yang menunjukkan penerapan teknik ini pada pencitraan sel hidup tunggal. Namun, penerapan LA-HTM untuk mempelajari mikroorganisme pada suhu tinggi tidaklah ambigu, karena memerlukan lebih banyak kehati-hatian dibandingkan dengan sel mamalia: pertama, memanaskan bagian bawah media sebesar puluhan derajat (bukan beberapa derajat) menyebabkan terhadap gradien suhu vertikal yang kuat. dapat menimbulkan konveksi cairan 44 yang jika tidak melekat erat pada substrat, dapat menyebabkan pergerakan dan percampuran bakteri yang tidak diinginkan. Konveksi ini dapat dihilangkan dengan mengurangi ketebalan lapisan cairan. Untuk tujuan ini, dalam semua percobaan yang disajikan di bawah ini, suspensi bakteri ditempatkan di antara dua kaca penutup setebal sekitar 15 µm yang ditempatkan di dalam cangkir logam (AttofluorTM, Thermofisher, Gambar 1b,c). Pada prinsipnya, konveksi dapat dihindari jika ketebalan cairan lebih kecil dari ukuran sinar laser pemanas. Kedua, bekerja dalam geometri terbatas dapat mencekik organisme aerobik (lihat Gambar S2). Masalah ini dapat dihindari dengan menggunakan substrat yang dapat ditembus oksigen (atau gas vital lainnya), dengan meninggalkan gelembung udara yang terperangkap di dalam kaca penutup, atau dengan mengebor lubang di bagian atas kaca penutup (lihat Gambar. S1) 45 . Dalam penelitian ini, kami memilih solusi terakhir (Gambar 1b dan S1). Terakhir, pemanasan laser tidak memberikan distribusi suhu yang seragam. Bahkan pada intensitas sinar laser yang sama (Gbr. 1d), distribusi suhu tidak seragam, melainkan menyerupai distribusi Gaussian karena difusi termal (Gbr. 1e). Ketika tujuannya adalah untuk menetapkan suhu yang tepat dalam bidang pandang untuk mempelajari sistem biologis, profil yang tidak rata tidaklah ideal dan juga dapat menyebabkan pergerakan bakteri secara termoforetis jika mereka tidak menempel pada substrat (lihat Gambar. S3, S4)39. Untuk tujuan ini, kami menggunakan modulator cahaya spasial (SLM) untuk membentuk sinar laser inframerah sesuai dengan bentuk cincin (Gbr. 1f) pada bidang sampel untuk mencapai distribusi suhu yang seragam sempurna dalam area geometris tertentu, meskipun terjadi difusi termal (Gbr. 1d) 39, 42, 46. Letakkan kaca penutup atas di atas cawan logam (Gambar 1b) untuk menghindari penguapan media dan amati setidaknya selama beberapa hari. Karena kaca penutup atas ini tidak disegel, media tambahan dapat dengan mudah ditambahkan kapan saja jika diperlukan.
Untuk mengilustrasikan cara kerja LA-HTM dan menunjukkan penerapannya dalam penelitian termofilik, kami mempelajari bakteri aerobik Geobacillus stearothermophilus, yang memiliki suhu pertumbuhan optimal sekitar 60-65°C. Bakteri ini juga memiliki flagela dan kemampuan berenang, yang merupakan indikator lain aktivitas seluler normal.
Sampel (Gbr. 1b) diinkubasi terlebih dahulu pada suhu 60 ° C selama satu jam dan kemudian ditempatkan di tempat sampel LA-HTM. Pra-inkubasi ini bersifat opsional, namun tetap berguna, karena dua alasan: Pertama, ketika laser dinyalakan, hal ini menyebabkan sel segera tumbuh dan membelah (lihat film M1 di Bahan Tambahan). Tanpa pra-inkubasi, pertumbuhan bakteri biasanya tertunda sekitar 40 menit setiap kali area pengamatan baru dipanaskan pada sampel. Kedua, pra-inkubasi 1 jam mendorong adhesi bakteri ke kaca penutup, mencegah sel-sel keluar dari bidang pandang karena termoforesis ketika laser dihidupkan (lihat film M2 dalam Bahan Tambahan). Termoforesis adalah pergerakan partikel atau molekul sepanjang gradien suhu, biasanya dari panas ke dingin, tidak terkecuali bakteri43,47. Efek yang tidak diinginkan ini dihilangkan pada area tertentu dengan menggunakan SLM untuk membentuk sinar laser dan mencapai distribusi suhu yang merata.
Pada gambar. Gambar 2 menunjukkan distribusi suhu yang diukur dengan CGM yang diperoleh dengan menyinari substrat kaca yang dilapisi nanopartikel emas dengan sinar laser berbentuk cincin (Gbr. 1f). Distribusi suhu yang datar diamati di seluruh area yang dicakup oleh sinar laser. Zona ini disetel pada 65°C, suhu pertumbuhan optimal. Di luar wilayah ini, kurva suhu secara alami turun menjadi \(1/r\) (dengan \(r\) adalah koordinat radial).
peta suhu pengukuran CGM yang diperoleh dengan menggunakan sinar laser annular untuk menyinari lapisan nanopartikel emas untuk mendapatkan profil suhu datar pada area melingkar. b Isoterm peta suhu (a). Kontur sinar laser diwakili oleh lingkaran titik-titik berwarna abu-abu. Percobaan diulangi dua kali (lihat Bahan Pelengkap, Gambar S4).
Viabilitas sel bakteri dipantau selama beberapa jam menggunakan LA-HTM. Pada gambar. 3 menunjukkan interval waktu untuk empat gambar yang diambil dari film berdurasi 3 jam 20 menit (Film M3, Informasi Tambahan). Bakteri diamati berkembang biak secara aktif dalam area melingkar yang ditentukan oleh laser di mana suhu optimal, mendekati 65°C. Sebaliknya, pertumbuhan sel berkurang secara signifikan ketika suhu turun di bawah 50°C selama 10 detik.
Gambar kedalaman optik bakteri G. stearothermophilus tumbuh setelah pemanasan laser pada waktu yang berbeda, (a) t = 0 menit, (b) 1 jam 10 menit, (c) 2 jam 20 menit, (d) 3 jam 20 menit, dari luar 200 Diekstraksi dari film satu menit (film M3 disediakan dalam Informasi Tambahan) yang ditumpangkan pada peta suhu yang sesuai. Laser menyala pada waktu \(t=0\). Isoterm telah ditambahkan ke gambar intensitas.
Untuk lebih mengukur pertumbuhan sel dan ketergantungannya pada suhu, kami mengukur peningkatan biomassa berbagai koloni bakteri yang awalnya diisolasi dalam bidang pandang Film M3 (Gbr. 4). Bakteri induk yang dipilih pada awal pembentukan unit pembentuk koloni mini (mCFU) ditunjukkan pada Gambar S6. Pengukuran massa kering dilakukan dengan kamera CGM 48 yang digunakan untuk memetakan distribusi suhu. Kemampuan CGM dalam mengukur berat kering dan suhu merupakan kekuatan LA-HTM. Seperti yang diharapkan, suhu tinggi menyebabkan pertumbuhan bakteri lebih cepat (Gbr. 4a). Seperti yang ditunjukkan pada plot semi-log pada Gambar 4b, pertumbuhan pada semua suhu mengikuti pertumbuhan eksponensial, di mana datanya menggunakan fungsi eksponensial \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), di mana \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – waktu pembangkitan (atau waktu penggandaan), \( g =1/ \tau\) – tingkat pertumbuhan (jumlah divisi per satuan waktu ). Pada gambar. Gambar 4c menunjukkan laju pertumbuhan dan waktu pembangkitan masing-masing sebagai fungsi suhu. mCFU yang tumbuh cepat ditandai dengan kejenuhan pertumbuhan setelah dua jam, suatu perilaku yang diharapkan karena kepadatan bakteri yang tinggi (mirip dengan fase diam dalam kultur cair klasik). Bentuk umum \(g\left(T\right)\) (Gbr. 4c) sesuai dengan kurva dua fase yang diharapkan untuk G. stearothermophilus dengan tingkat pertumbuhan optimal sekitar 60-65°C. Cocokkan data menggunakan model utama (Gambar S5)49 di mana \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, yang sesuai dengan nilai lain yang dikutip dalam literatur49. Meskipun parameter yang bergantung pada suhu dapat direproduksi, laju pertumbuhan maksimum \({G}_{0}\) dapat bervariasi dari satu percobaan ke percobaan lainnya (lihat gambar S7-S9 dan film M4). Berbeda dengan parameter penyesuaian suhu, yang harus bersifat universal, laju pertumbuhan maksimum bergantung pada sifat medium (ketersediaan nutrisi, konsentrasi oksigen) dalam geometri skala mikro yang diamati.
a Pertumbuhan mikroba pada berbagai suhu. mCFU: Unit Pembentuk Koloni Miniatur. Data diperoleh dari video satu bakteri yang tumbuh dalam gradien suhu (film M3). b Sama seperti (a), skala semi-logaritmik. c Laju pertumbuhan\(\tau\) dan waktu pembangkitan\(g\) dihitung dari regresi linier (b). Bilah kesalahan horizontal: kisaran suhu di mana mCFU meluas ke bidang pandang selama pertumbuhan. Bilah kesalahan vertikal: kesalahan standar regresi linier.
Selain pertumbuhan normal, beberapa bakteri terkadang terlihat selama pemanasan laser, yang merupakan perilaku yang diharapkan dari bakteri dengan flagela. Film M5 di informasi tambahan menampilkan aktivitas berenang seperti itu. Dalam percobaan ini, radiasi laser seragam digunakan untuk membuat gradien suhu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1d, e dan S3. Gambar 5 menunjukkan dua rangkaian gambar yang dipilih dari film M5 yang menunjukkan bahwa satu bakteri menunjukkan gerakan terarah sementara semua bakteri lainnya tetap tidak bergerak.
Dua kerangka waktu (a) dan (b) menunjukkan berenangnya dua bakteri berbeda yang ditandai dengan lingkaran putus-putus. Gambar diekstraksi dari film M5 (disediakan sebagai materi tambahan).
Dalam kasus G. stearothermophilus, pergerakan aktif bakteri (Gbr. 5) dimulai beberapa detik setelah sinar laser dinyalakan. Pengamatan ini menekankan respon temporal mikroorganisme termofilik terhadap peningkatan suhu, seperti yang telah diamati oleh Mora et al. 24. Topik motilitas bakteri dan bahkan termotaksis dapat dieksplorasi lebih lanjut menggunakan LA-HTM.
Renang mikroba tidak sama dengan jenis gerak fisik lainnya, yaitu (i) Gerak Brown, yang tampak seperti gerak kacau tanpa arah yang pasti, (ii) konveksi 50 dan termoforesis 43, terdiri dari gerak melayang teratur sepanjang suhu. gradien.
G. stearothermophilus dikenal karena kemampuannya menghasilkan spora yang sangat tahan (pembentukan spora) bila terkena kondisi lingkungan yang merugikan sebagai pertahanan. Ketika kondisi lingkungan kembali mendukung, spora berkecambah, membentuk sel-sel hidup dan melanjutkan pertumbuhan. Meskipun proses sporulasi/perkecambahan ini sudah banyak diketahui, namun belum pernah diamati secara langsung. Dengan menggunakan LA-HTM, kami melaporkan di sini pengamatan pertama peristiwa perkecambahan pada G. stearothermophilus.
Pada gambar. Gambar 6a menunjukkan gambar selang waktu kedalaman optik (OT) yang diperoleh dengan menggunakan 13 spora CGM. Sepanjang waktu pengumpulan (15 jam 6 menit, \(t=0\) – awal pemanasan laser), 4 dari 13 spora berkecambah, pada titik waktu berturut-turut \(t=2\) jam, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' dan \(11\) h \(30\)'. Meskipun hanya satu peristiwa yang ditunjukkan pada Gambar 6, 4 peristiwa perkecambahan dapat diamati pada film M6 pada materi tambahan. Menariknya, perkecambahan tampaknya terjadi secara acak: tidak semua spora berkecambah dan tidak berkecambah pada saat yang bersamaan, meskipun terjadi perubahan kondisi lingkungan yang sama.
a Time-lapse yang terdiri dari 8 gambar PL (perendaman minyak, 60x, objektif 1,25 NA) dan (b) evolusi biomassa agregat G. stearothermophilus. c (b) Digambar pada skala semi-log untuk menonjolkan linearitas laju pertumbuhan (garis putus-putus).
Pada gambar. Gambar 6b,c menunjukkan biomassa populasi sel di bidang pandang sebagai fungsi waktu selama seluruh periode pengumpulan data. Peluruhan cepat massa kering diamati pada \(t=5\)h pada gambar. 6b, c, karena keluarnya beberapa sel dari bidang pandang. Laju pertumbuhan keempat kejadian ini adalah \(0,77\pm 0,1\) h-1. Nilai ini lebih tinggi dari laju pertumbuhan yang terkait dengan Gambar 3.3 dan 4, dimana sel tumbuh normal. Alasan peningkatan laju pertumbuhan G. stearothermophilus dari spora tidak jelas, namun pengukuran ini menyoroti minat LA-HTM dan bekerja pada tingkat sel tunggal (atau pada tingkat mCFU tunggal) untuk mempelajari lebih lanjut tentang dinamika kehidupan sel. .
Untuk lebih menunjukkan keserbagunaan LA-HTM dan kinerjanya pada suhu tinggi, kami menguji pertumbuhan Sulfolobus shibatae, archaea asidofilik hipertermofilik dengan suhu pertumbuhan optimal 80°C51. Dibandingkan dengan G. stearothermophilus, archaea ini juga memiliki morfologi yang sangat berbeda, menyerupai bola berukuran 1 mikron (kokus) dan bukan batang memanjang (basil).
Gambar 7a terdiri dari gambar kedalaman optik berurutan dari S. shibatae mCFU yang diperoleh menggunakan CGM (lihat film fitur M7 di Bahan Tambahan). mCFU ini tumbuh pada suhu sekitar 73°C, di bawah suhu optimal 80°C, tetapi dalam kisaran suhu untuk pertumbuhan aktif. Kami mengamati beberapa peristiwa fisi yang membuat mCFU terlihat seperti anggur mikro archaea setelah beberapa jam. Dari gambar PL ini, biomassa mCFU diukur dari waktu ke waktu dan disajikan pada Gambar 7b. Menariknya, mCFU S. shibatae menunjukkan pertumbuhan linier daripada pertumbuhan eksponensial seperti yang terlihat pada mCFU G. stearothermophilus. Terdapat diskusi panjang 52 mengenai sifat laju pertumbuhan sel: meskipun beberapa penelitian melaporkan laju pertumbuhan mikroba sebanding dengan ukurannya (pertumbuhan eksponensial), penelitian lainnya menunjukkan laju yang konstan (pertumbuhan linier atau bilinear). Seperti yang dijelaskan oleh Tzur et al.53, membedakan antara pertumbuhan eksponensial dan (bi)linier memerlukan ketelitian <6% dalam pengukuran biomassa, yang tidak dapat dicapai oleh sebagian besar teknik QPM, bahkan yang melibatkan interferometri. Seperti yang dijelaskan oleh Tzur et al.53, membedakan antara pertumbuhan eksponensial dan (bi)linier memerlukan ketelitian <6% dalam pengukuran biomassa, yang tidak dapat dicapai oleh sebagian besar teknik QPM, bahkan yang melibatkan interferometri. Seperti yang terjadi pada bulan dan bulan 53, nilai yang diharapkan dan (lebih lanjut) adalah nilai <6% в из мерениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, с использованием интерферометрии. Seperti yang dijelaskan oleh Zur et al.53, membedakan antara pertumbuhan eksponensial dan (bi)linier memerlukan akurasi <6% dalam pengukuran biomassa, hal ini tidak dapat dicapai oleh sebagian besar metode QPM, bahkan menggunakan interferometri.Seperti yang dijelaskan oleh Zur dkk. 53, membedakan antara pertumbuhan eksponensial dan (bi)linier memerlukan akurasi kurang dari 6% dalam pengukuran biomassa, yang tidak dapat dicapai oleh sebagian besar metode QPM, bahkan ketika interferometri digunakan. CGM mencapai akurasi ini dengan akurasi sub-pg dalam pengukuran biomassa36,48.
a Time-lapse yang terdiri dari 6 gambar PL (perendaman minyak, 60x, tujuan NA 1,25) dan (b) evolusi biomassa mikro-CFU diukur dengan CGM. Lihat film M7 untuk informasi lebih lanjut.
Pertumbuhan S. shibatae yang linier sempurna tidak terduga dan belum dilaporkan. Namun, pertumbuhan eksponensial diperkirakan terjadi, setidaknya karena seiring berjalannya waktu, pembelahan ganda dari 2, 4, 8, 16… sel harus terjadi. Kami berhipotesis bahwa pertumbuhan linier mungkin disebabkan oleh penghambatan sel karena kepadatan sel, seperti halnya pertumbuhan sel yang melambat dan akhirnya mencapai keadaan tidak aktif ketika kepadatan sel terlalu tinggi.
Kami menyimpulkan dengan membahas lima hal menarik berikut ini: pengurangan volume pemanasan, pengurangan inersia termal, minat terhadap nanopartikel emas, minat terhadap mikroskop fase kuantitatif, dan kemungkinan kisaran suhu di mana LA-HTM dapat digunakan.
Dibandingkan dengan pemanasan resistif, pemanasan laser yang digunakan untuk pengembangan HTM menawarkan beberapa keunggulan, yang kami ilustrasikan dalam penelitian ini. Khususnya, dalam media cair di bidang pandang mikroskop, volume pemanasan dijaga dalam beberapa (10 μm) 3 volume. Dengan cara ini, hanya mikroba yang diamati yang aktif, sementara bakteri lain tidak aktif dan dapat digunakan untuk mempelajari sampel lebih lanjut – tidak perlu mengganti sampel setiap kali suhu baru perlu diperiksa. Selain itu, pemanasan skala mikro memungkinkan pemeriksaan langsung pada rentang suhu yang luas: Gambar 4c diperoleh dari film berdurasi 3 jam (Film M3), yang biasanya memerlukan persiapan dan pemeriksaan beberapa sampel – satu untuk setiap sampel yang diteliti. y adalah suhu yang mewakili jumlah hari dalam percobaan. Mengurangi volume panas juga menjaga seluruh komponen optik di sekitar mikroskop, terutama lensa objektif, tetap berada pada suhu ruangan, yang selama ini menjadi permasalahan utama yang dihadapi masyarakat. LA-HTM dapat digunakan dengan lensa apa pun, termasuk lensa imersi minyak, dan akan tetap berada pada suhu ruangan bahkan dengan suhu ekstrem di bidang pandang. Keterbatasan utama metode pemanasan laser yang kami laporkan dalam penelitian ini adalah bahwa sel yang tidak menempel atau mengapung mungkin jauh dari pandangan dan sulit untuk dipelajari. Solusinya adalah dengan menggunakan lensa pembesaran rendah untuk mencapai kenaikan suhu yang lebih besar, yaitu melebihi beberapa ratus mikron. Kehati-hatian ini dibarengi dengan penurunan resolusi spasial, namun jika tujuannya adalah untuk mempelajari pergerakan mikroorganisme, resolusi spasial yang tinggi tidak diperlukan.
Skala waktu untuk pemanasan (dan pendinginan) sistem \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{\mbox{D}}}}\) bergantung pada ukurannya, sesuai dengan hukum \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), di mana \ (L\ ) adalah ukuran karakteristik sumber panas (diameter sinar laser dalam penelitian kami adalah \(L\ sekitar 100\) μm), \(D\) adalah difusivitas termal lingkungan (rata-rata dalam penelitian kami wadah, gelas dan air Laju difusi\(D\ sekitar 2\kali lipat {10}^{-7}\) m2/s). Oleh karena itu, dalam penelitian ini, respons waktu sekitar 50 ms, yakni kuasi-seketika perubahan suhu dapat diperkirakan terjadi secara instan. Peningkatan suhu secara instan ini tidak hanya memperpendek durasi percobaan, namun juga memungkinkan penentuan waktu yang tepat \(t=0\) untuk studi dinamis mengenai efek suhu.
Metode yang kami usulkan dapat diterapkan pada semua substrat penyerap cahaya (misalnya, sampel komersial dengan lapisan ITO). Namun, nanopartikel emas mampu memberikan serapan tinggi pada inframerah dan serapan rendah pada rentang tampak, karakteristik terakhir ini menarik untuk pengamatan optik yang efektif dalam rentang tampak, terutama bila menggunakan fluoresensi. Selain itu, emas bersifat biokompatibel, inert secara kimia, kerapatan optik dapat disesuaikan dari 530 nm hingga inframerah dekat, dan preparasi sampel sederhana dan ekonomis29.
Mikroskopi muka gelombang kisi transversal (CGM) tidak hanya memungkinkan pemetaan suhu pada skala mikro, tetapi juga pemantauan biomassa, sehingga sangat berguna (jika tidak diperlukan) jika dikombinasikan dengan LA-HTM. Selama dekade terakhir, teknik mikroskop suhu lainnya telah dikembangkan, khususnya di bidang bioimaging, dan sebagian besar memerlukan penggunaan probe fluoresen yang sensitif terhadap suhu54,55. Namun, metode ini telah dikritik dan beberapa laporan telah mengukur perubahan suhu yang tidak realistis di dalam sel, mungkin karena fakta bahwa fluoresensi bergantung pada banyak faktor selain suhu. Selain itu, sebagian besar probe fluoresen tidak stabil pada suhu tinggi. Oleh karena itu, QPM dan khususnya CGM merupakan teknik mikroskop suhu ideal untuk mempelajari kehidupan pada suhu tinggi menggunakan mikroskop optik.
Studi terhadap S. shibatae, yang hidup optimal pada suhu 80°C, menunjukkan bahwa LA-HTM dapat diterapkan untuk mempelajari hipertermofil, bukan hanya termofil sederhana. Pada prinsipnya, tidak ada batasan kisaran suhu yang dapat dicapai dengan menggunakan LA-HTM, dan bahkan suhu di atas 100°C dapat dicapai pada tekanan atmosfer tanpa mendidih, seperti yang ditunjukkan oleh kelompok kami yang terdiri dari 38 orang dalam aplikasi kimia hidrotermal di atmosfer. tekanan A. Laser digunakan untuk memanaskan nanopartikel emas 40 dengan cara yang sama. Dengan demikian, LA-HTM mempunyai potensi untuk digunakan untuk mengamati hipertermofil yang belum pernah terjadi sebelumnya dengan mikroskop optik resolusi tinggi standar dalam kondisi standar (yaitu di bawah tekanan lingkungan).
Semua percobaan dilakukan menggunakan mikroskop buatan sendiri, termasuk penerangan Köhler (dengan LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), pemegang spesimen dengan gerakan xy manual, tujuan (Olympus, 60x, 0,7 NA, udara, LUCPlanFLN60X atau 60x, 1,25 NA, Minyak , UPLFLN60XOI), kamera CGM (QLSI cross grating, pitch 39 µm, 0,87 mm dari sensor kamera Andor Zyla) untuk memberikan pencitraan intensitas dan muka gelombang, dan kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mode 16-bit, dari Hamamatsu) untuk merekam data yang ditunjukkan pada Gambar 5 (berenang bakteri). Pemisah berkas dichroic adalah tepi BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filter di bagian depan kamera adalah short pass filter 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser safir titanium (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, rongga laser tsunami yang dipompa, Spectra-Fisics pada Gambar 2-5, selanjutnya digantikan oleh laser Millenia, Spectraphysics 10 W, rongga laser Mira yang dipompa, Koheren, untuk Gambar. 2 -5). 6 dan 7) diatur ke panjang gelombang \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, yang sesuai dengan spektrum resonansi plasmon nanopartikel emas. Modulator cahaya spasial (1920 × 1152 piksel) dibeli dari Meadowlark Optics. Hologram dihitung menggunakan algoritma Gerchberg-Saxton seperti yang dijelaskan dalam tautan 39.
Mikroskop muka gelombang kisi silang (CGM) adalah teknik mikroskop optik yang didasarkan pada penggabungan kisi difraksi dua dimensi (juga dikenal sebagai kisi silang) pada jarak satu milimeter dari sensor kamera konvensional. Contoh paling umum dari CGM yang kami gunakan dalam penelitian ini disebut interferometer pergeseran transversal empat panjang gelombang (QLSI), di mana kisi silang terdiri dari pola kotak-kotak intensitas/fase yang diperkenalkan dan dipatenkan oleh Primot dkk. pada tahun 200034. Garis kisi vertikal dan horizontal menciptakan bayangan seperti kisi pada sensor, distorsi yang dapat diproses secara numerik secara real time untuk mendapatkan distorsi muka gelombang optik (atau profil fase setara) dari cahaya yang datang. Saat digunakan pada mikroskop, kamera CGM dapat menampilkan perbedaan jalur optik dari suatu objek yang dicitrakan, juga dikenal sebagai kedalaman optik (OT), dengan sensitivitas sekitar nanometer36. Dalam pengukuran CGM apa pun, untuk menghilangkan cacat apa pun pada komponen atau berkas optik, gambar OT referensi utama harus diambil dan dikurangi dari gambar berikutnya.
Mikroskop suhu dilakukan menggunakan kamera CGM seperti dijelaskan dalam referensi. 32. Singkatnya, pemanasan suatu cairan akan mengubah indeks biasnya, sehingga menciptakan efek lensa termal yang mendistorsi sinar datang. Distorsi muka gelombang ini diukur dengan CGM dan diproses menggunakan algoritma dekonvolusi untuk mendapatkan distribusi suhu tiga dimensi pada media cair. Jika nanopartikel emas didistribusikan secara merata ke seluruh sampel, pemetaan suhu dapat dilakukan di area bebas bakteri untuk menghasilkan gambar yang lebih baik, dan hal ini terkadang kami lakukan. Gambar referensi CGM diperoleh tanpa pemanasan (dengan laser mati) dan kemudian ditangkap di lokasi yang sama pada gambar dengan laser menyala.
Pengukuran massa kering dilakukan dengan menggunakan kamera CGM yang sama dengan yang digunakan untuk pencitraan suhu. Gambar referensi CGM diperoleh dengan memindahkan sampel secara cepat ke dalam x dan y selama pemaparan sebagai cara untuk merata-ratakan ketidakhomogenan dalam PL karena adanya bakteri. Dari gambar bakteri PL, biomassanya diperoleh dengan menggunakan kumpulan gambar pada area yang dipilih menggunakan algoritma segmentasi buatan Matlab (lihat subbagian “Kode numerik”), mengikuti prosedur yang dijelaskan dalam ref. 48. Singkatnya, kita menggunakan relasi \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), dengan \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) adalah gambar kedalaman optik, \(m\) adalah berat kering dan \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) adalah konstanta. Kami memilih \({{{{\rm{\alpha)))))=0,18\) µm3/pg, yang merupakan konstanta umum untuk sel hidup.
Kaca penutup berdiameter 25 mm dan tebal 150 µm yang dilapisi dengan nanopartikel emas ditempatkan ke dalam ruang AttofluorTM (Thermofisher) dengan nanopartikel emas menghadap ke atas. Geobacillus stearothermophilus diprakultur semalaman dalam medium LB (200 rpm, 60°C) sebelum setiap hari percobaan. Setetes 5 μl suspensi G. stearothermophilus dengan kepadatan optik (OD) 0,3 hingga 0,5 ditempatkan pada kaca penutup dengan nanopartikel emas. Kemudian, kaca penutup bundar berdiameter 18 mm dengan lubang berdiameter 5 mm di tengahnya dijatuhkan ke tetesan tersebut, dan 5 μl suspensi bakteri dengan kerapatan optik yang sama diaplikasikan berulang kali ke tengah lubang. Sumur pada kaca penutup disiapkan sesuai dengan prosedur yang dijelaskan dalam ref. 45 (lihat Informasi Tambahan untuk informasi lebih lanjut). Kemudian tambahkan 1 ml medium LB ke dalam kaca penutup untuk mencegah lapisan cairan mengering. Kaca penutup terakhir ditempatkan di atas tutup ruang Attofluor™ yang tertutup untuk mencegah penguapan media selama inkubasi. Untuk percobaan perkecambahan, kami menggunakan spora, yang, setelah percobaan konvensional, terkadang menutupi kaca penutup bagian atas. Metode serupa digunakan untuk memperoleh Sulfolobus shibatae. Tiga hari (200 rpm, 75°C) budidaya awal Thiobacillus serrata dilakukan dalam medium 182 (DSMZ).
Sampel nanopartikel emas dibuat dengan litografi kopolimer blok misel. Proses ini dijelaskan secara rinci dalam Bab. 60. Secara singkat, misel yang membungkus ion emas disintesis dengan mencampurkan kopolimer dengan HAuCl4 dalam toluena. Kaca penutup yang telah dibersihkan kemudian direndam dalam larutan tersebut dan diberi perlakuan penyinaran UV dengan adanya zat pereduksi sehingga diperoleh biji emas. Akhirnya, benih emas ditanam dengan mengontakkan kaca penutup dengan larutan KAuCl4 dan etanolamin selama 16 menit, yang menghasilkan susunan nanopartikel emas non-bola yang kuasi-periodik dan sangat seragam dalam inframerah dekat.
Untuk mengonversi interferogram menjadi gambar PL, kami menggunakan algoritme buatan sendiri, sebagaimana dirinci dalam tautan. 33 dan tersedia sebagai paket Matlab di repositori publik berikut: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket ini dapat menghitung intensitas dan gambar PL berdasarkan rekaman interferogram (termasuk gambar referensi) dan jarak susunan kamera.
Untuk menghitung pola fase yang diterapkan pada SLM untuk mendapatkan profil suhu tertentu, kami menggunakan algoritma buatan sendiri yang dikembangkan sebelumnya39,42 yang tersedia di repositori publik berikut: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Inputnya adalah bidang suhu yang diinginkan, yang dapat diatur secara digital atau melalui gambar bmp monokrom.
Untuk mengelompokkan sel dan mengukur berat keringnya, kami menggunakan algoritme Matlab yang dipublikasikan di repositori publik berikut: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Pada setiap gambar, pengguna harus mengklik bakteri atau mCFU yang diinginkan, menyesuaikan sensitivitas tongkat, dan mengonfirmasi pilihan.
Untuk informasi lebih lanjut tentang desain penelitian, lihat abstrak Laporan Penelitian Alam yang ditautkan ke artikel ini.
Data yang mendukung hasil penelitian ini tersedia dari masing-masing penulis berdasarkan permintaan yang masuk akal.
Kode sumber yang digunakan dalam penelitian ini dirinci di bagian Metode, dan versi debug dapat diunduh dari https://github.com/baffou/ di repositori berikut: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, dan CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Wawasan tentang termofil dan aplikasi spektrum luasnya. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Wawasan tentang termofil dan aplikasi spektrum luasnya.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. dan Sharma, AK Ikhtisar termofil dan penerapannya yang luas. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. dan Sharma AK Pemahaman mendalam tentang termofil dan beragam aplikasi.3 Bioteknologi 6, 81 (2016).
Waktu posting: 26 Sep-2022